Estudio de la condrogénesis in vitro de células madre mesenquimales humanas procedentes de membrana sinovial y estroma de cordón umbilical

Resumo

En este trabajo desarrollamos un protocolo de aislamiento de células madre mesenquimales (CMMs) procedentes de dos tipos de tejidos, la membrana sinovial y el estroma del cordón umbilical humanos. Comprobamos si las células extraídas son CMMs para lo cual, realizamos una caracterización fenotípica para observar la presencia o ausencia de los marcadores clásicos de CMMs mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia. Después realizamos una caracterización génica dónde observamos la expresión de genes de células indiferenciadas mediante PCR a tiempo real, y por último realizamos una caracterización biológica para testar la pluripotencia de las células extraídas de estos dos tejidos y comprobar si poseen capacidad para diferenciarse hacia varias líneas celulares, adipocitos, osteocitos, miocitos o progenitores neuronales. Una vez comprobada la procedencia mesenquimal de nuestras células madre y su potencialidad nos centramos en la capacidad condrogénica de las subpoblaciones de CMMs procedentes de la membrana sinovial enriquecidas en los marcadores CD73, CD105, CD106 y CD271 así como de las CMMs procedentes del estroma del cordón umbilical humanos, estableciendo un nuevo modelo de condrogénesis in vitro mediante un medio de diferenciación específico a través de la formación de esferoides, los cuales se recogieron después de 14, 28 y 46 días en cultivo en medio condrogénico en el caso de las CMMs procedentes de membrana sinovial y después de 4, 7, 14, 28 y 46 días en cultivo con el medio condrogénico, en el caso de los esferoides de las CMMs procedentes del estroma del cordón umbilical, para su posterior estudio. Se evaluó la estructura de los esferoides a los diferentes tiempos del modelo de condrogénesis mediante tinciones de hematoxilina-eosina para observar su morfología y estructura, así como el azul alcián para evaluar la presencia de proteínas en la matriz extracelular que las células en proceso de diferenciación van secretando al exterior. También estudiamos la expresión de dos proteínas importantes para la condrogénesis mediante inmunohistoquímicas de los esferoides a los diferentes tiempos contra las proteínas de colágeno tipo I (col 1) y el colágeno tipo II (col 2), así como su expresión a nivel génico mediante PCR a tiempo real. Para evaluar si en la condrogénesis se estaba produciendo hipertrofia de las células, hemos realizado inmunohistoquímica contra la proteína del colágeno tipo X y la metaloproteasa 13, así como su validación mediante PCR a tiempo real para observar la expresión a nivel de ARNm de los genes que codifican para estas proteínas. Una vez testado el potencial condrogénico de nuestras células madre se estudió el conjunto de proteínas que se están expresando durante el proceso de condrogénesis de nuestro modelo, tanto de las proteínas que las células están secretando, mediante una primera separación realizada por nanoLC e identificación peptídica por Maldi TOF/TOF, así como de las proteínas intracelulares de las células madre mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano, mediante DIGE, y posterior identificación de los péptidos por Maldi TOF/TOF.