Clonación de una sonda de ADN para la detección no isotópica de genes de resistencia a antibióticos beta-lactámicos en aislados clínicos

Resumo

Los métodos tradicionales para detectar resistencias bacterianas a los antibióticos son demasiado lentos como para tenerlos en cuenta en las decisiones terapéuticas iniciales. Aplicando técnicas de recombinación genética e hibridaciones moleculares se pueden acelerar. Por ello se ha obtenido una sonda de ADN específica para los genes que codifican betalactamas, principal mecanismo de las bacterias patógenas para ser resistentes a los beta-lactámicos. El trabajo se inicio seleccionando un grupo de E.coli productores de beta-lactamasas plasmídicas de amplio espectro (determinando su mínima concentración inhibitoria - CMI -, su producción de beta-lactamasas, extrayendo sus plásmidos y transformándolos en una bacteria receptora). A continuación se caracterizaron los plásmidos de resistencia (estudiando su fenotipo (por su CMI y por el tipo de beta-lactamasa producida). Y su genotipo (determinando el peso molecular de cada plásmido y su mapa de restricción). Por ultimo, se clono en el vector pRK el gen de resistencia y se subclono en el vector pACXC184 hasta tener un inserto de 1.6 Kb, que se uso como sonda de ADN. Esta sonda se marco con fotobiotina y demostró ser especifica para las beta-lactamasas tipo TEM. Se hibridó con aislados clínicos por southern-blot, dot-blot e hibridación de colonias y el sistema de detección fue tan sensible como los radioisotópicos.