Proteómica en drosophila melanogaster

Resumo

El disco imaginal de ala de Drosophila melanogaster y conocer las proteínas implicadas en su desarrollo y morfogénesis, son el objetivo principal de esta tesis. La base de datos de proteínas de disco imaginal de ala se ha obtenido tras la utilización de dos técnicas analíticas: la electroforesis bidimensional de alta resolución (2D-PAGE) y la espectrometría de masas (MS). Para ello, se marcaron con 35[S]Met+35[S]Cys los polipéptidos procedentes de la línea celular Schneider y se obtuvo su mapa bidimensional; el cual se comparó con el mapa bidimensional del disco imaginal de ala. Tras determinar las diferencias cualitativas y cuantitativas, se observo que ambos sistemas presentaban más de 600 polipéptidos comunes. Para la identificación por espectrometría de masas, se realizaron geles bidimensionales preparativos con una mezcla de polipéptidos aislados a partir de células Schneider y discos imaginales de ala marcados radiactivamente, y se analizaron mediante MALDI-TOF (Matriz Asisted Laser Desorption/Ionization ¿ Time Of Flight) aquellos polipéptidos comunes a ambos sistemas. Mediante este abordaje experimental se identificaron 159 proteínas de la base de datos del disco imaginal de ala. Asimismo, se caracterizaron el protema mitocondrial y ribosomal de Drosophila, mediante el aislamiento y purificación de dichos orgánulos a partir de larvas de tercer estadio y generando su mapa bidimensional mediante 2D-PAGE. La base de datos 2D mitocondrial contenía 231 polipéptidos, y la ribosomal, 58. El análisis por MALDI-TOF, identificó 66 proteínas mitocondriales y 52 ribosomales de las bases de datos correspondientes. El objetivo principal de estos estudios es la identificación de proteínas de Drosophila cuyo nivel de expresión esté aumentado o disminuído entre los diferentes discos de larva de tercer estadio y/o entre diferentes estadios durante su desarrollo. Ese es el caso de SSP 6002, que se identificó mediante huella peptídica como la proteína de choque térmico, Heat Shock Protein 23 (HSP23). La caracterización del patrón de expresión durante el desarrollo mediante un anticuerpo generado contra la proteína nativa, reveló su implicación en la morfogénesis del disco imaginal de ala. La expresión HSP23 está bajo el control del complejo AS-C, conjunto de genes que especifican los territorios proneurales en el disco imaginal; y se mantiene inalterado en condiciones de choque térmico. Tras estos resultados, extendimos el estudio a otra proteína de choque térmico, HSP60A, caracterizándose su patrón de expresión con un anticuerpo contra el polipéptido nativo. El análisis inmunohistoquímico de discos imaginales y embriones, mostró la localización mitocondrial de HSP60A y un patrón de expresión altamente dinámico durante la embriogénesis, que se mantenía en condiciones de estrés térmico. La regulación de la expresión de HSP60A se producía a nivel post-transcripcional, aunque en situaciones de estrés (apoptosis y altas temperaturas) su expresión se regula a nivel transcripcional en todo el embrión.