Estabilidad plasmídica y expresión en procesos con levaduras recombinantes inmovilizadas

Resumo

Uno de los problemas más importantes en la aplicación industrial de los microorganismos recombinantes es la inestabilidad plasmídica. El objetivo de este trabajo fue el estudio de estrategias de operación que permitan mejorar la estabilidad plasmídica y expresión enzimática en procesos con levaduras recombinantes inmovilizadas. Se ha empleado como modelo una cepa de S. cerevisiae modificada genéticamente, que porta el gen EXG1, el cual codifica la síntesis de la enzima exo-beta-glucanasa. En primer lugar, se estudiaron los parámetros cinéticos y estequiométricos de la levadura recombinante en procesos discontinuos con el microorganismo libre e inmovilizado en alginato-Ca, comparando el comportamiento del microorganismo recombinante, con el de la cepa mutada que no presenta actividad exo-beta-glucanasa. La comparación se realizó en base a las velocidades de crecimiento, expresión enzimática y estabilidad plasmídica operando con medios selectivo y no selectivo. Con el objetivo de estudiar la influencia que ejercen algunas variables de operación sobre la estabilidad plasmídica y actividad recombinante, se llevó a cabo un diseño factorial de experimentos. Las variables bajo estudio fueron la concentración celular de inóculo, concentración de sustrato y velocidad de agitación. Para estudiar la influencia de la concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo y de la relación C/N se desarrollaron tres fermentaciones en tanque agitado operando en continuo, con la cepa recombinante inmovilizada. La primera fermentación se llevó a cabo bajo condiciones anacrobias, la segunda en condiciones aerobias, disminuyendo el flujo de aire hasta condiciones microaerobias y la tercera, en condiciones aerobias con una relación C/N limitante en nitrógeno. En todos los casos se utilizó un medio complejo para permitir la competencia de las células portadoras y no portadoras de plásmido. Por último,