Aplicación de la inmunohistoquímica al diagnóstico de vitalidad en las heridas cutáneas incisas

Resumen

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS El diagnóstico de vitalidad de las heridas cutáneas es un problema que se plantea con frecuencia en Patología Forense. El diagnóstico diferencial entre heridas vitales y post mórtem se basa generalmente en el estudio macroscópico complementado con la histología convencional y resulta menos difícil cuando las heridas vitales tienen un tiempo largo de evolución o ante lesiones post mórtem producidas mucho después del fallecimiento. En la práctica, sin embargo, el patólogo forense se ha de enfrentar a heridas ocurridas muy próximas al momento de la muerte y puede ser necesario el uso de técnicas complementarias que se han ido desarrollando. Entre ellas están la microscopía electrónica, la histoquímica enzimática, diferentes métodos bioquímicos, la inmunohistoquímica (IHQ) y, más recientemente, la biología molecular. Muchas de estas técnicas presentan, sin embargo, inconvenientes y como método de estudio de la reacción vital y la data de las heridas, la IHQ ofrece ventajas que la han convertido en el método de elección en las investigaciones actuales sobre esta materia (Grellner y Madea 2007). En el presente trabajo doctoral nos hemos propuesto como objetivo analizar en heridas cutáneas incisas mediante IHQ la expresión de fibronectina (FN) y tenascina (TN), apoptosis, caspasa-3 y Bcl-2, ciclooxigenasa-2 (COX-2), cadherina E, cateninas ¿, ß y ¿ y selectina P, así como analizar la influencia de los artefactos de autolisis / putrefacción en los resultados de IHQ. Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 2 INTRODUCCIÓN 1.- EL PROBLEMA DE LA REACCIÓN VITAL. La aparición de lesiones post mórtem puede ser accidental (durante la manipulación del cadáver en el levantamiento, el transporte o la autopsia, o producida por animales) o intencionada: de origen yatrogénico, o heridas dolosas con el fin de ocultar o sugerir un crimen, un accidente o un suicidio, o para impedir la identificación de un cuerpo (Hernández-Cueto 2004). El diagnóstico de vitalidad constituye uno de los objetivos principales del análisis medicolegal de las heridas cutáneas y resulta menos difícil en lesiones evolucionadas, cuando el individuo sobrevivió cierto tiempo tras la agresión. Los mayores problemas aparecen en las heridas que han ocurrido muy próximas al momento de la muerte, especialmente durante la agonía terminal o en el denominado periodo supravital inicial. Será función del patólogo forense detectar reacción vital de muy poco tiempo de evolución, e intentar diferenciarla de reacciones agónicas y supravitales y de cambios post mórtem (Oehmichen 2004). 2.- MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN DE VITALIDAD EN HERIDAS CUTÁNEAS. La respuesta vital que se produce en una herida cutánea consiste en la reacción inflamatoria y reparación tisular subsiguiente, y los métodos de investigación de vitalidad tienen como objetivo detectar si se han producido estos procesos. En el último medio siglo se han ido desarrollando diferentes metodologías para intentar ayudar al diagnóstico, como han sido técnicas de histoquímica, bioquímica y microscopía electrónica (Hernández-Cueto y cols. 2000). Los avances en la resolución del problema se han producido paralelamente a la evolución en el conocimiento de los mecanismos íntimos de la curación de la herida. 3.- LA IHQ EN EL ESTUDIO DE LA REACCIÓN VITAL. La reacción inflamatoria y curación de la herida cutánea implica complejas interacciones entre muchos tipos de células, con la intervención de diversas sustancias mediadoras de la inflamación y de componentes de la matriz extracelular (MEC), y todos estos elementos han sido objeto de estudio en diferentes trabajos. Los marcadores que han recibido más atención en la literatura o que presentan potencial interés se pueden clasificar en los siguientes grupos: Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 3 1- Moléculas proinflamatorias: entre ellas, se han investigado las citoquinas (sobre todo las interleuquinas 1, 6 y 10) y quemoquinas (Grellner 2002; Kondo y Ohshima 1996) 2- Moléculas de adhesión: se han postulado como muy útiles las selectinas (Dressler y cols. 1998). 3-Proteínas de la MEC: destaca la FN como marcador temprano de vitalidad y los diferentes tipos de colágeno, útiles para establecer la data de la herida. (Betz y cols. 1992; Betz 1996). 4- Células de la inflamación y reparación. 5- Factores relacionados con crecimiento y muerte celular: se ha estudiado tanto la actividad proliferativa (por ejemplo determinando Ki67) como la muerte celular (nivel de apoptosis) (Betz y cols. 1997). 6- Citoesqueleto y proteínas intracelulares musculares. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS A continuación se resumen los materiales y métodos empleados y los resultados obtenidos que se refieren en los siete artículos publicados que integran esta tesis. 1: Detección IHQ de fibronectina y tenascina en heridas incisas de piel humana. Estudiamos la expresión de FN y tenascina (TN) en 58 heridas cutáneas humanas (48 vitales y 10 post mórtem). La edad de las heridas vitales variaba de 3 minutos a 8 horas y las muestras post mórtem fueron recogidas después de un intervalo tras la incisión de 15-180 minutos. Ciento treinta y siete secciones de tejido fijado en formol e incluído en parafina (media: 2.3 secciones por caso) se tiñeron con cada uno de los anticuerpos frente a FN y TN usando la técnica StreptABC (Complejo estreptavidina biotina). Se observó una tinción reticular para FN en el borde de la herida y en la dermis en el 50% de las muestras vitales frente al 0% de los casos post mórtem. La inmunorreactividad se redujo en 10 casos autolizados. En el 39.4% de las heridas vitales y el 60 % de los casos post mórtem se observó positividad para FN exclusivamente en el margen de la herida. La TN fue negativa en todas las muestras. Las áreas de hemorragia vitales y post mórtem presentaron positividad para FN y TN. Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 4 2: Expresión de fibronectina y tenascina como demostración de reacción vital en la piel y el músculo de rata. Analizamos la expresión de FN y TN en heridas infligidas a 12 ratas adultas en la piel del abdomen. Se practicó una herida incisa a los 5, 10 o 15 minutos antes de la muerte y otra a los 5 minutos después de ser sacrificadas, la cual se recogió a los 45 minutos. Se tiñeron mediante IHQ secciones fijadas en formol e incluídas en parafina de un total de 36 muestras (media: 1.5 por herida) siguiendo la técnica StreptABC. El estudio microscópico reveló una tinción de patrón reticular para FN en 18 de las 20 muestras vitales, y, para TN, en 16 sobre el total de 20, así como en 2 de 16 muestras post mórtem para FN y 3 de 16 post mórtem para TN. Se observó tinción intracelular de fibras musculares en 7 de las 20 muestras vitales y en 5 del total de 16 post mórtem. 3: Demostración de apoptosis en heridas de piel humana como un indicador de reacción vital. Utilizamos una técnica de marcaje in situ (Apop-Tag®) en 30 heridas quirúrgicas en piel humana con una edad de la herida que variaba desde 3 minutos a 8 horas. Encontramos queratinocitos apoptóticos en más del 50% de los casos con un intervalo posterior a la producción de la herida de al menos 120 minutos. No se observó apoptosis en heridas de menos de 120 minutos o en la piel normal, que se utilizó como control externo. 4: Análisis de la expresión de caspasa-3 y proteína Bcl-2 como posibles marcadores de vitalidad en heridas cutáneas. El estudio ha incluído 30 muestras procedentes de heridas incisas cutáneas humanas: 16 vitales obtenidas de incisiones quirúrgicas, con evolución de 3 minutos a 8 horas, y 14 post mórtem procedentes de incisiones abdominales de necropsia, que se recogieron al cabo de 1-3 horas de ser producidas. Se realizó técnica IHQ sobre secciones fijadas en formol e incluídas en parafina con el método de estreptavidina marcada-biotina (LSAB2®, DakoCytomation, Dinamarca) y anticuerpos frente a caspasa-3 (CPP32) (policlonal, 1:100) y Bcl-2 (clon 124, 1:20) (DakoCytomation, Dinamarca). No hubo inmunotinción para Bcl-2 en los queratinocitos en ninguna de las heridas estudiadas. Sólo fueron positivas algunas células linfoides, que sirvieron como control interno de la técnica. CPP32 fue también negativa en la epidermis y sólo se observó tinción ocasional de capilares y fibroblastos. No se encontró sobreexpresión de Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 5 ambos marcadores al comparar el borde de la herida con el margen opuesto de la muestra ni las heridas vitales con las post mórtem. 5: Análisis de la expresión de ciclooxigenasa-2 como un posible marcador de vitalidad en heridas cutáneas. Se estudiaron 41 muestras de heridas cutáneas incisas humanas, incluyendo: 16 heridas vitales con edad de 3 minutos a 8 horas (media: 125 minutos), 14 producidas post mórtem (recogidas después de un periodo de 1-3 horas), y 11 cicatrices de incisiones quirúrgicas suturadas cuyo tiempo de evolución era de 0.5 a 11 meses. Se tiñeron mediante IHQ secciones fijadas en formol e incluídas en parafina con la técnica de estreptavidina marcada-biotina utilizando un anticuerpo monoclonal anti COX-2 (DakoCytomation). Todas las muestras mostraron inmunorreactividad normal para la COX-2 en las glándulas ecrinas, con tinción débil de las glándulas sebáceas y la capa basal de la epidermis. No se observaron diferencias de tinción al comparar el borde de la herida con el margen opuesto de la muestra, ni entre las heridas vitales y las post mórtem. Las cicatrices con reacción inflamatoria en la dermis (con edad igual a 0.5 a 3 meses) presentaron sobreexpresión de COX-2 en histiocitos y células mononucleares. 6: Expresión de cadherina E y cateninas en heridas cutáneas vitales y post mórtem. El estudio incluyó 42 heridas incisas humanas (32 vitales y 10 post mórtem) y 3 cicatrices cutáneas. Las heridas vitales procedían de incisiones quirúrgicas abdominales con un intervalo tras la herida comprendido entre 55 minutos y 8 horas. Dos de las cicatrices tenían 2 meses y la otra 5 meses de evolución. Las muestras post mórtem se obtuvieron de incisiones abdominales autópsicas y se recogieron después de un periodo medio de 105 minutos (rango: 15-180). Se tiñeron mediante IHQ secciones fijadas en formol e incluídas en parafina, con la técnica de estreptavidina marcada-biotina y anticuerpos monoclonales frente a cadherina E (BioGenex) y cateninas alfa, beta y gamma (Transduction Laboratories). Se evaluó la tinción del borde de la herida comparándolo con el margen opuesto de la muestra. Se constataron diferencias sutiles de tinción entre los dos bordes de la muestra en 11 casos (9 vitales y 2 post mórtem). Había aumento de tinción en el borde correspondiente a la herida en 7 casos y en el margen control en 4. Las diferencias correspondieron a la cadherina E en 5 casos, la catenina alfa y la gamma en 3. No se apreciaron diferencias para la catenina beta. Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 6 7: Análisis inmunohistoquímico de la selectina P como posible marcador de vitalidad en heridas cutáneas humanas. Cuarenta y cinco heridas cutáneas incisas (24 vitales, 14 post mórtem, 7 en las que se indujo autolisis/putrefacción) se tiñeron mediante IHQ con anticuerpos frente a selectina P y CD31. Se calculó el porcentaje de luces teñidas con selectina P sobre el total de vasos positivos para CD31 (índice S-P/CD31) en ambos bordes de cada muestra. En las muestras vitales el índice S-P/CD31 osciló entre 10.7% y 71.4% en el borde de la herida, y entre el 12.5 y el 58.8 % en el margen opuesto, con un cociente entre ambos índices de 0.37-1.77 (media: 0.94). En los casos post mórtem, el índice variaba desde el 22.5% al 69.2% en el borde de herida, y del 28 al 89.5% en el margen opuesto, con un cociente entre ambos índices de 0.76-1.9 (media: 0.96). Las diferencias entre los cocientes no fueron estadísticamente significativas, lo que impedía una valoración de vitalidad. DISCUSIÓN 1.- MOLÉCULAS DE LA MEC: FN y TN. Una de las moléculas que ha recibido más atención en los estudios de IHQ aplicados a la Patología Forense ha sido la FN, que se ha propuesto como un buen marcador de reacción vital en diferentes tejidos. Betz y cols. describieron como patrón vital de expresión IHQ de la FN, una tinción reticular en la dermis adyacente al borde de la herida y propusieron, por tanto, que es un marcador de vitalidad de gran sensibilidad, detectable en heridas de pocos minutos de evolución (Betz y cols. 1992). En nuestra serie, sin embargo, la sensibilidad de la técnica ha sido más baja y destaca la heterogeneidad de los resultados. Sólo encontramos tinción reticular en la mitad de las heridas vitales estudiadas (19 de 38 casos) y casi todas las restantes (15 casos) la presentaron en el borde de la herida, sin tinción en red, lo que resultaba inaceptable como positividad de la prueba. Por otra parte cabe señalar que los casos positivos tenían una edad mínima de 20 minutos y en las 4 heridas de sólo 3-10 minutos no hubo tinción. Además, el diámetro máximo del área de tinción reticular fue muy variable (0.1 a 4.1 mm) y no todas las secciones de las heridas positivas presentaron este patrón. En lo que se refiere a la TN, la tinción fue negativa en todos los casos vitales de edad comprendida entre 3 minutos y 8 horas, así como en las heridas post mórtem, por lo que el marcador no ha sido útil. TN se sobreexpresó en las cicatrices (de 20 a 82 días de evolución, media: 41.6). Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 7 Hay que señalar que las áreas de hemorragia han presentado positividad para FN y TN, tanto en heridas vitales como post mórtem, con lo cual la prueba pierde valor. La comparación entre heridas vitales y post mórtem producidas en intervalos muy cortos antes o después de la muerte con cronología bien controlada, sólo es posible en heridas experimentales. Por ello hemos estudiado mediante IHQ ambas moléculas en una serie de heridas en piel de rata. Aunque en la mayoría de las heridas vitales encontramos tinción reticular para los dos marcadores (90% para FN y 80% para TN) la reacción no fue completamente específica y se observó en algunas heridas post mórtem (12.5% para FN y 18.7% para TN). Esta falta de especificidad ya se había comunicado previamente en algún otro estudio (Grellner y cols. 1998). La falta de especificidad es aún más destacable en el caso de la reactividad intracelular para FN del músculo estriado esquelético, que está descrita como signo de vitalidad (Fechner y cols. 1993), y nosotros constatamos con frecuencia muy similar tanto en heridas vitales como post mórtem (35% frente a 31.25% respectivamente). Por último hemos observado en la rata que el patrón IHQ de reacción para FN y TN fue diferente al de la piel humana tanto en la piel normal como en las heridas. Esto pone de manifiesto la necesidad de complementar las investigaciones en animales, que sirven como fuente de conocimiento básico del problema, con estudios sobre material humano. 2.- APOPTOSIS Y PROTEÍNAS RELACIONADAS (CASPASA-3 Y BCL-2). 2.1.- Detección de apoptosis. Existen pocos trabajos publicados sobre la aplicación del estudio de la apoptosis al análisis de la herida. Betz y cols. consideran que la detección de fibroblastos dérmicos en apoptosis es útil para datar heridas cutáneas: la presencia de más de una célula positiva en un área de 0.01 x 0.01 cm indicaría una edad mínima de la herida de un día y si hay más de 3 células, de al menos 19 días (Betz y cols. 1997). Estos autores no consideraron los resultados en la epidermis para eliminar el error que se produciría por la apoptosis fisiológica. En nuestro estudio, los resultados más significativos se produjeron, sin embargo, en la epidermis y los controles que incluímos de piel normal fueron negativos con la técnica utilizada (método TUNEL, Kit Apop-Tag®). Hemos observado positividad nuclear en los fibroblastos dérmicos de 17 heridas sobre un total de 20 casos de 60-360 minutos de evolución y, en menor grado, en adipocitos y células Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 8 endoteliales. El hallazgo de células positivas en la dermis puede ser, por tanto, un marcador de vitalidad, pero los resultados son más llamativos en la epidermis. Detectamos apoptosis en los queratinocitos de los estratos profundos de la epidermis (basal y espinoso) en 8 de los 15 casos de 120-360 minutos de evolución, que era más evidente en el borde correspondiente a la herida o, incluso, en toda la muestra. Llaman la atención las diferencias en la cronología de la positividad de la técnica al comparar nuestros resultados con otros trabajos que utilizaron el mismo método (Betz y cols. 1997; Sawaguchi y cols. 2000). Esta discordancia se podría poner en relación con las diferencias en el tipo de material utilizado (muestras de autopsia frente a heridas quirúrgicas sin autolisis en nuestro caso), el retraso en la fijación y, un factor importante, el tipo de lesiones estudiadas, que en la serie de Sawaguchi y cols. correspondían a contusiones. 2.2.- Proteínas relacionadas con apoptosis: caspasa-3 y Bcl-2. En nuestra serie, el análisis de IHQ de Bcl-2 y de caspasa-3 (CPP32) en 16 heridas vitales y 14 post mórtem en piel humana no ha mostrado cambios en la expresión. Bcl-2 fue negativo en la epidermis de manera constante (únicamente se tiñeron ocasionales linfocitos de la dermis) y CPP-32 se expresó en ocasionales fibroblastos y aislados vasos. No hubo diferencias de inmunotinción entre ambos bordes de las muestras ni entre las lesiones vitales y las post mórtem, por lo que no sirven como marcadores de vitalidad. Ello puede estar en relación con el poco tiempo de evolución de nuestros casos, teniendo en cuenta los resultados de Kane y Greenhalgh, que comunican el aumento de Bcl-2 en heridas de 12 horas en ratón (Kane y Greenhalgh 2000). 3.- MOLÉCULA PROINFLAMATORIA: COX-2. No hay apenas estudios sobre la determinación IHQ de COX-2 en heridas cutáneas en general y los pocos que existen se realizaron en especies diferentes a la humana (Futagami y cols. 2002). Algunos trabajos analizan mediante método bioquímico los niveles de COX-2 ante diferentes estímulos con discrepancias en los resultados: el comienzo de la inducción de COX-2 después del estímulo se registra en un intervalo que va desde las 3 a las 12 horas ( He y cols. 2001; Futagami y cols. 2002). En nuestro estudio, que incluyó heridas vitales con un amplio rango de edades así como lesiones post mórtem, no se objetivaron diferencias en la inmunorreactividad para COX-2 que hicieran posible su uso como marcador de vitalidad. La expresión de COX-2 se produjo en células mononucleares, presentes de manera incidental en la piel Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 9 (tres heridas de 3 minutos, 30 minutos y 4 horas de evolución), y en las lesiones antiguas en cicatrización (con edad de 0.5 a 3 meses). Un hallazgo significativo fue la discrepancia en el patrón de inmunotinción de COX-2 en la piel normal que podemos observar en los diferentes trabajos y también constatamos en nuestros resultados. Se ha descrito positividad para COX-2 en epidermis, anejos dérmicos, endotelio y fibroblastos en los distintos estudios (Abd-El- Aleem y cols. 2001; Futagami y cols. 2002). Nosotros encontramos expresión normal en glándulas sudoríparas ecrinas y, con tinción débil, en glándulas sebáceas y la capa basal de la epidermis. 4.- MOLÉCULAS DE ADHESIÓN: CADHERINA E Y CATENINAS; SELECTINA P. 4.1.- Cadherina E y cateninas. El análisis IHQ de cadherinas y cateninas podría ser útil para demostrar el comienzo de la reepitelización que, mediante histología de rutina, no se objetiva hasta los 3-6 días. Por ello, hemos investigado si existen cambios detectables mediante IHQ en la expresión de cadherina E y las tres cateninas (¿, ß y ¿) en heridas cutáneas, vitales y post mórtem, de horas de evolución (en las vitales, desde 55 minutos a 8 horas y en las post mórtem, de 15 a 180 minutos). El método ha permitido demostrar de manera eficaz las cuatro moléculas en la epidermis normal con un patrón intercelular o paramembranoso respectivamente, pero no se han encontrado en las heridas cambios útiles para el diagnóstico: las diferencias sutiles de inmunotinción que hemos observado en 11 de los 42 casos estudiados (9 heridas vitales y 2 post mórtem) al comparar el margen de la herida con el otro borde de la muestra, no estaban relacionados con el tipo de lesión (vital o post mórtem), la edad de la herida ni el tipo de borde. Estos resultados se podrían explicar por una sensibilidad relativamente baja de la técnica IHQ o el tiempo corto de evolución de nuestros casos. 4.2.- Selectina P. La selectina P ha sido investigada desde el punto de vista de la Patología Forense por el grupo de Dressler que ha descrito la expresión de este marcador en heridas vitales de 3 minutos a 7 horas de evolución y no en las lesiones post mórtem (Dressler y cols. 1998). Estos autores analizaron mediante IHQ el porcentaje de vasos que expresaban selectina P comparando heridas vitales con muestras de piel sana de los Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 10 mismos individuos. Nuestro método ha sido diferente, centrándonos en el estudio del borde de la herida y considerando como control el margen opuesto de la muestra, siguiendo una aproximación al problema similar a la de los estudios sobre la FN y otros marcadores (Betz y cols. 1992). Para ello valoramos de manera semicuantitativa el porcentaje de pequeños vasos que expresaban selectina P sobre el total determinado con tinción con un marcador endotelial como es CD31. Analizamos ambos bordes (la herida y el opuesto) y calculamos la relación entre ambos porcentajes. En nuestra serie hemos encontrado resultados muy variables para este índice en ambos márgenes: en heridas vitales oscilaba entre 10.7 71.4 en el borde de herida y 12.5 58.8 en el opuesto. En heridas post mórtem el índice variaba entre 22.5 69.2 y 28 - 89.5, respectivamente. Cuando determinamos la relación entre ambos porcentajes no encontramos diferencias estadísticamente significativas entre las heridas vitales y las post mórtem. Las diferencias en los números absolutos se deben, probablemente, al distinto tamaño de las muestras por su forma de obtención, siendo más gruesas las procedentes de necropsia. Una discrepancia más significativa con el estudio de Dressler y cols. fue la presencia de inmunorreactividad para selectina P en las muestras de piel de cadáver en nuestra serie mientras que dichos autores señalan que no detectaron selectinas en el 90% de las heridas inducidas post mórtem, refiriendo únicamente tinción de baja intensidad para la selectina P en el 13% de los vasos (Dressler y cols. 1998). 5.- INFLUENCIA DE AUTOLISIS Y PUTREFACCIÓN EN LOS RESULTADOS DE IHQ. Uno de los factores críticos en los resultados de las técnicas de IHQ es la calidad de la fijación del tejido, que incluye la ausencia de fenómenos de autolisis y putrefacción. La influencia de estos fenómenos en los resultados de IHQ varía según el marcador analizado, entre otros factores, y ha sido analizada en dos de nuestros estudios. Prácticamente en todos nuestros casos en los que se indujo el artefacto desapareció la inmunorreactividad para FN. Estos resultados son similares a los de Betz y cols. que también refieren una disminución de la tinción de FN en la piel que sufrió putrefacción (Betz y cols. 1993). En el caso de la TN, el análisis del artefacto de autolisis y putrefacción no fue posible porque ya no había expresión de la molécula en las muestras bien conservadas. Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 11 En nuestro estudio de la selectina P, se ponen de manifiesto las diferencias dependiendo de la proteína analizada, puesto que para este anticuerpo sí se conservaba la inmunorreactividad. Sin embargo, en la mayoría de los casos aparecieron dos de los problemas habituales en el tejido mal fijado: la positividad fue más débil y apareció tinción de fondo. Además todas las muestras presentaron mayor disrupción tisular, probablemente en relación con la menor resistencia de los tejidos autolizados al tratamiento de desenmascaramiento antigénico (calentamiento en olla a presión). Estos artefactos hacen muy difícil una valoración microscópica ya de por sí compleja y subjetiva, y en estas circunstancias fue prácticamente imposible hacer una determinación semicuantitativa de vasos positivos. CONCLUSIONES 1.- La IHQ puede ayudar al diagnóstico de vitalidad de las heridas cutáneas incisas pero presenta importantes limitaciones. Es necesario el uso de varios marcadores, la comparación del borde de la herida con un control y se tendrán más en cuenta los resultados positivos que los negativos. 2.- El análisis de la FN es útil para el diagnóstico de vitalidad de las heridas, pero la inmunorreactividad en las lesiones vitales no es tan precoz ni tan frecuente como se ha descrito, existiendo además heterogeneidad en la tinción entre diferentes secciones de un mismo caso. Las áreas de hemorragia dificultan la interpretación y pueden generar falsos positivos. 3.- El estudio de la TN no reveló sobreexpresión en heridas de corta evolución por lo que este marcador no es útil, siendo positivo sólo en cicatrices. 4.- En la rata se han encontrado diferencias de tinción IHQ para FN y TN: aunque se observó el patrón reticular de reacción vital, fue menos específico y se presentó en algunos casos post mórtem. En el tejido muscular, la positividad intracelular ocurrió con frecuencia similar en heridas vitales y post mórtem, por lo que no es posible el diagnóstico diferencial. 5.- La detección de apoptosis en la piel mediante técnica de marcaje in situ de fragmentos de ADN, ha mostrado resultados más concluyentes en la epidermis que en la dermis y puede ser un marcador de vitalidad. Debido a los problemas de especificidad del método se requiere confirmación de los resultados mediante estudios adicionales. El análisis IHQ de Bcl-2 y caspasa-3 no ha sido útil para dicha finalidad. 6.- El estudio IHQ de COX-2 no sirve para el diagnóstico de vitalidad de heridas cutáneas incisas. La expresión de COX-2 está relacionada con la presencia de infiltrado Resumen Tesis Doctoral José Antonio Ortiz Rey 12 inflamatorio linfocítico o histiocitario, por lo que sería más característica de lesiones de tiempo largo de evolución. 7.- El análisis IHQ de la cadherina E y de las cateninas ¿, ß y ¿, no ha mostrado que sean útiles como marcadores de vitalidad. 8.- La evaluación IHQ de la selectina P mediante la comparación del borde de la herida con el margen opuesto de la muestra, no ha sido útil para el diagnóstico de vitalidad. Además el porcentaje de vasos que expresan selectina presenta gran variabilidad interindividual. 9.- La influencia de la autolisis y la putrefacción en los resultados de IHQ varía según el marcador. Se observó pérdida de inmunorreactividad para FN mientras que se conservó para selectina P, aunque la intensidad fue débil y la tinción de fondo y la fragmentación del tejido hicieron prácticamente imposible la valoración microscópica. 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