Sensibilización frente a antígenos de parásitos responsables de helmintozoonosis y artritis reumatoide

Resumen

Las posibilidades de contacto entre personas y animales se incrementan con la tenencia de mascotas, o mediante la explotación de animales de renta, lo que favorece la exposición a determinados agentes patógenos, que pueden afectar tanto a personas como a animales y que son responsables de enfermedades que se denominan zoonosis. Es importante tener en cuenta que el contacto con estos patógenos o sus antígenos no sólo puede provocar graves alteraciones en las personas al desarrollarse la infección, sino también otras repercusiones de naturaleza autoinmnitaria. Existe un riesgo de exposición particularmente elevado a algunas formas de resistencia de parásitos helmintos, como por ejemplo sucede con huevos de nematodos ascáridos del género Toxocara, los cuales poseen una cubierta externa formada por tres capas que le confieren una notable resistencia, incluso en condiciones desfavorables y ello hace que las posibilidades de infección de personas y animales se prolonguen en el tiempo. Esta envoltura consta de una capa externa formada por polisacáridos y proteínas; otra intermedia constituida por un complejo quitín-proteico, y una interna (vitelina) a base de proteínas (25%) y lípidos (75%), que les permite también sobrevivir a la acción de diferentes productos desinfectantes, por lo que pueden mantener su infectividad durante meses, e incluso años (Ayçiçek et al., 2001). Para controlar la presencia de formas parasitarias de resistencia, en clínicas veterinarias, caniles, criaderos, granjas, etc. se emplean diferentes agentes desinfectantes, de probada acción frente a agentes microbianos, pero cuya actividad frente a los parásitos se desconoce. Por este motivo, en el primer ensayo de esta Tesis se evaluó la eficacia de tres productos empleados de forma rutinaria en instalaciones en las que se alojan perros, sobre el desarrollo embrionario de huevos de Toxocara canis, mediante técnicas in vitro e in vivo. En los estudios in vitro, los huevos del parásito de sometieron a la acción controlada de etanol, hipoclorito sódico y una mezcla comercial de cloruro de benzalconio y formaldehído. Después de un periodo de incubación de 24 días, se demostró que el etanol era el mejor desinfectante porque impedía el desarrollo larvario de T. canis en el interior de los huevos, seguido por el hipoclorito sódico que permitió el desarrollo del 50% de las formas de resistencia y finalmente por el preparado comercial que sólo degeneró el 25%. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Verocai et al. (2010). Por el contrario, Ayçiçek et al. (2001) afirmaron que el hipoclorito sódico no tenía efecto sobre la viabilidad de los huevos de T. canis, corroborando los datos obtenidos por Juris y Breza (1988). En investigaciones previas, Burg y Borgsteede (1987) afirmaron que productos como el fenol, cresol, hidróxido sódico y potasa, sales de amonio cuaternario glutaraldehído y formaldehído eran ineficaces sobre huevos embrionados y no-embrionados de A. suum. En el ensayo in vivo se administraron a ratones que son hospedadores paraténicos al igual que el hombre, huevos embrionados con L2 que habían resistido a la acción de los dos desinfectantes. La eficacia de los productos se determinó sobre el cerebro mediante la observación de larvas a los 24 días post-infección. No se encontraron lesiones ni larvas del nematodo en los ratones que recibieron larvas de T. canis tratadas con hipoclorito sódico, al contrario de lo que sucedió en los que se infectaron con huevos expuestos al desinfectante comercial. Estos resultados muestran que tanto el etanol como el hipoclorito sódico son apropiados para la desinfección de locales en los que se mantienen animales, debido a su completa eficacia frente a las fases infectantes de T. canis, por lo que se recomienda su uso en criaderos, caniles, jaulas y clínicas veterinarias para evitar el riesgo de infección de las personas. Chung et al. (2004) demostraron que al menos el 50% de huevos embrionados que se conservaron en formalina a 4ºC durante 21 meses podían desarrollarse hasta las fases infectivas. El conocimiento de que en el medio ambiente pueden encontrarse un gran número de formas de resistencia de parásitos helmintos con elevada resistencia a productos desinfectantes y condiciones climáticas adversas, nos indujo a considerar que el riesgo de exposición a estos parásitos o a sus derivados antigénicos podría ser importante en la población humana. El diagnóstico de algunas helmintozoonosis se puede realizar mediante técnicas coprológicas como la flotación (nematodos) o sedimentación (trematodos). Sin embargo, sólo se pueden aplicar en aquellas especies en las que se completa el ciclo endógeno (hospedadores definitivos). El principal helminto en perros es T. canis, y A. suum en el ganado porcino en explotaciones familiares. Fasciola hepatica es el trematodo de mayor prevalencia entre los rumiantes domésticos. De estas tres helmintozoonosis frecuentes en la Comunidad Autónoma Gallega, sólo la fasciolosis se puede detectar por coprología en personas (Sánchez-Andrade et al., 2008). En diferentes investigaciones se ha puesto de manifiesto que la infección por parásitos helmintos induce en los hospedadores una respuesta inmnunitaria inicial de tipo Th1, definida por la producción de IL-2, IL-6, IFN-¿, TNF-¿, que es reemplazada por otra de tipo Th2, definida por la síntesis de citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 que inducen la diferenciación de linfocitos B a la producción de anticuerpos IgE (Finkelman et al., 2004; Pearce et al., 2005). En el segundo estudio se analizó la posible asociación entre la presencia de anticuerpos IgG frente a los antígenos de excreción/secreción de Toxocara canis, Ascaris suum y Fasciola hepatica y el lugar de residencia de las personas analizadas. Entre marzo de 2007 y enero de 2008 se recogieron muestras de sangre de 1.206 personas que se agruparon en función del lugar de residencia y del género. Se empleó la técnica inmunoezimática ELISA para evaluar la presencia de anticuerpos séricos frente a antígenos de excreción/secreción de los helmintos (sensibilización). El porcentaje de casos positivos a T. canis resultó del 13% (95% CI, 11-15), 45% (44-49) a A. suum y 23% (21-25) a F. hepatica. Se comprobó que, en general, el porcentaje de sensibilización fue significativamente superior en mujeres del ámbito rural. Además, los pacientes sensibilizados frente a estos helmintos presentaron recuentos más elevados de neutrófilos y el riesgo de desarrollo de anticuerpos IgG frente a los antígenos de T. canis, A. suum y F. hepatica fue superior en la población de áreas rurales; en este sentido, se evidenció que las mujeres residentes en zonas rurales mostraron mayor riesgo de sensibilización frente a A. suum. Entre las posibles causas de zoonosis se baraja la estrecha relación que se establece entre los animales y sus cuidadores, que unida a condiciones sanitarias precarias, favorece el contagio y desarrollo de ciertas enfermedades parasitarias (Gil y Sanmartino, 2002; Domenech et al., 2006). Los resultados del presente trabajo parecen confirmar que las posibilidades de contacto con diferentes antígenos guarda relación con el medio en el que se desenvuelven los individuos. (Macpherson, 2005). Sin embargo, aunque existe una creencia muy extendida acerca de que la población urbana tiene más cuidado de perros y gatos, y se le presume un contacto exagerado con sus mascotas, en el presente trabajo se obtuvo la seroprevalencia más elevada de toxocariosis en pacientes residentes en el campo, lo que coincide con investigaciones previas en Suecia (Ljungström y Van Knapen, 1989; Zwolinski, 2000). En la población en estudio se observó una elevada seroprevalencia de ascariosis, que parece deberse a los hábitos de cría tradicional de los suidos en la Comunidad Autónoma Gallega. Las mujeres suelen encargarse de la alimentación del ganado, y también de la elaboración de productos alimenticios a partir de la carne de los animales, situaciones ambas que facilitan que su sistema inmunitario entre en contacto con antígenos de parásitos que afectan a los suidos. Se ha descrito que la cría de cerdos en explotaciones familiares propicia el contacto con diferentes organismos parasitarios (Bucardo et al., 2005). La exposición a antígenos de A. suum guarda estrecha relación con la presencia de ganado porcino. La ausencia de datos acerca de la prevalencia de ascariosis porcina en la región donde se llevó a cabo el presente estudio limita la discusión de los resultados obtenidos. Se ha detectado que el 21'5% de los suidos de los países nórdicos tienen animales que eliminan huevos de A. suum (Roepstorff et al., 1999). La infección en población humana es relativamente escasa en esta área (2 casos/10.000 habitantes al año), con mayor frecuencia entre niños que visitan zonas rurales (36 casos/10.000 habitantes al año) (Nejsum et al., 2005). Pinelli et al. (2008) demostraron que el 7% de los niños de Holanda de 4 años de edad habían desarrollado anticuerpos frente a A. suum. Se estableció una asociación positiva entre la seroprevalencia de anticuerpos, disnea, asma y sensibilización frente a alergenos del aire, concluyendo que la infección breve o leve estimula la respuesta alérgica. Es importante destacar que el contacto con huevos embrionados de A. suum se puede producir de diferentes formas, y no es necesaria la presencia de ganado porcino, puesto que los huevos de A. suum pueden sobrevivir a variaciones notables de temperatura, permaneciendo viables en el ambiente durante mucho tiempo (Bergstrom y Langeland, 1981). De este modo, la ingestión de vegetales frescos cultivados empleando estiércol de cerdo, o de hígado crudo de pollos o terneros pueden facilitar la ingestión de los huevos del ascárido (Vázquez-Tsuji et al., 1997; Taira et al., 2004). Entre las formas más frecuentes de ingestión metacercarias de F. hepatica se ha destacado el consumo de ensaladas a base de berros, hojas de lechuga, alfalfa o espinacas producidas en áreas con importante presencia de rumiantes domésticos infectados (Marcos et al., 2005). La fasciolosis es una trematodosis de amplia distribución en rumiantes de Galicia, como lo demuestra el hallazgo de porcentajes de infección del 70% en bovinos y 55% en ovinos (Sánchez-Andrade et al., 2000; Paz-Silva et al., 2003), lo que podría explicar el porcentaje de sensibilización obtenido en este estudio. En diversas investigaciones se ha señalado que la infección por helmintos estimula no sólo la producción de anticuerpos, sino también la de algunos elementos celulares (linfocitos, eosinófilos, neutrófilos). Con tal motivo, el hallazgo de eosinofilia en pacientes se ha relacionado desde hace algún tiempo con infecciones parasitarias, así como fenómenos de alergia (Kwon et al., 2006) y de desórdenes inmunitarios (Wardlaw y Kay, 1987). Se ha demostrado que los helmintos tienen la capacidad de modificar la respuesta inmunitaria de sus hospedadores, modulándola de forma que pueden reducir su intensidad, o incluso en opinión de algunos investigadores de inducir el desarrollo de fenómenos de autoinmunidad (Maizels y Yazdanbakhsh, 2003). En el desarrollo de patología autoinmune intervienen anticuerpos y componentes mediados por células (Kim y Polychronakos, 2005). En ocasiones algunos pacientes presentan manifestaciones inflamatorias en las articulaciones debido a la liberación de antígenos parasitarios que inducen la formación de inmunocomplejos séricos que alcanzan el fluido sinovial (Doury, 1990). Considerando los resultados obtenidos en el segundo ensayo, el principal objetivo de la tercera parte del trabajo consistió en analizar la posible relación entre la presencia de eosinofilia, sensibilización frente al trematodo Fasciola hepatica y autoinmunidad. Para ello, se utilizaron muestras de sangre de 1264 pacientes con eosinofilia procedentes del Hospital Xeral de Lugo. En función del recuento de eosinófilos se establecieron 3 grupos, eosinofilia leve (<0'5 109/litro), moderada (0'5-3 109/litro) y elevada (>3 109/litro). El grado de sensibilización frente al trematodo se determinó enfrentando los sueros a antígenos de excreción/secreción obtenidos de F. hepatica mediante una prueba de enzimoinmunoensayo (ELISA). Se empleó asimismo una técnica de aglutinación en látex para poner en evidencia la presencia de autoanticuerpos FR-IgM. Los resultados determinaron que el 21% de los pacientes mostraban sensibilidad frente a antígenos del trematodo F. hepatica y que el 15% tenían FR-IgM. La población femenina de áreas rurales presentaban las seroprevalencias más elevadas de infección por Fasciola hepatica y de autoinmunidad, mientras que los varones residentes en el medio rural tenían los porcentajes más altos de eosinofilia. Es importante destacar que las mujeres suelen encargarse de la alimentación del ganado, y también de la elaboración de productos alimenticios a partir de la carne de los animales, situaciones ambas que facilitan que su sistema inmunitario entre en contacto con antígenos de parásitos que afectan a rumiantes (Fasciola) a los suidos (Ascaris). Los pacientes no sensibilizados mostraban mayor esosinofilia que los sensibilizados, lo que parece indicar paradójicamente que el contacto con formas parasitarias no siempre aumenta la eosinofilia y que ésta puede obedecer a muy diversas causas (Hanvivatvong et al., 2003). Sin embargo, sí se observó relación entre la presencia de autoanticuerpos FR-Ig y la eosinofilia, lo que coincide con la hipótesis sugerida por Kaplan et al. (2005) acerca de la relación entre la producción de autoanticuerpos y el contacto con ganado o con el suelo. De los resultados obtenidos se deduce que en el área de estudio, los residentes en zonas rurales tienen más probabilidad de exposición a antígenos de F. hepatica que los residentes en áreas urbanas y que el desarrollo de eosinofilia y de autoinmunidad están relacionados. Se ha demostrado la coincidencia de FR y de infecciones parasitarias en casos de anisakiosis (Cuende et al., 1998), esquistomosis (Rolland et al., 1998) ascariosis (Carballada et al., 1998) y estrongiloidosis (Brocq et al., 1996; Richter et al., 2006). Ante los datos obtenidos en este tercer estudio, y puesto que la sensibilización frente a antígenos de A. suum fue muy elevada en la zona de estudio, como se demostró en el segundo ensayo, nos planteamos un cuarto trabajo para verificar la hipótesis de que la exposición a este ascárido pudiera estar relacionado de alguna forma con la respuesta eosinófila y la autoinmunidad. Se utilizaron sueros de 1264 pacientes que vivían habitualmente en medio rural o urbano y que además presentaban eosinofilia. La sensibilización frente al ascárido se evaluó mediante ELISA con antígeno de excreción/secreción de A. suum. Se utilizó también una prueba de aglutinación en látex para determinar los niveles de autoanticuerpos FR-IgM. Como en el estudio anterior, se comprobó que la población que vive en el medio rural tiene mayor probabilidad de sensibilizarse frente a A. suum y se demostró asimismo una relación positiva entre la eosinofilia y el desarrollo de autoanticuerpos FR-IgM. En este ensayo, nuevamente se observó que los porcentajes más elevados de sensibilización frente a antígenos de A. suum y de autoinmunidad correspondieron a mujeres que residían en áreas rurales, mientras que los hombres presentaron los valores más altos de eosinofilia. Finalmente, planteamos un quinto estudio con objeto de comprobar la posible relación entre la artritis reumatoide y el nivel de sensibilización de estos pacientes a antígenos de F. hepatica y A. suum. En el Servicio de Reumatología del Hospital Xeral de Lugo, se seleccionaron de forma aleatoria 359 personas en las que se determinó si padecían artritis reumatoide basandos en los criterios de la Asociación Americana de Reumatología. Además, mediante ELISA, se determinó la presencia de anticuerpos IgG frente a Fasciola hepatica y Ascaris suum. Los resultados se analizaron teniendo en cuenta el sexo y el modo de vida de los pacientes. El porcentaje de pacientes en los que se diagnosticó artritis reumatoide fue del 33% y se encontraron diferencias significativas en función del sexo, correspondiendo la mayor prevalencia a las mujeres. Como en los estudios anteriores, se comprobó que la población rural presentaba seroprevalencia positiva más alta a F. hepatica y A. suum que la urbana. Se debe destacar que solo se detectaron anticuerpos de F. hepatica en los pacientes con artritis reumatoide y que la seroprevalencia de A. suum fue más alta en personas diagnosticadas de artritis reumatoide. El análisis conjunto de los resultados obtenidos indica la probabilidad significativamente más elevada de sensibilización frente a antígenos de helmintos entre los individuos con artritis reumatoide que viven en zonas rurales, lo que sugiere que el hábitat y el modo de vida están estrechamente relacionados con el grado de desarrollo de anticuerpos frente a estos helmintos y con la artritis reumatoide.