Identificación y caracterización de los genes espumantes FPG1 de Saccharomyces cerevisiae y CFG1 de Saccharomyces pastorianus (carlsbergensis)

Abstract

Identificación y caracterización de los genes espumantes FPG1 de Saccharomyces cerevisiae y CFG1 de Saccharomyces pastorianus (carlsbergensis). Lucía Blasco Otero Dep. Microbiología e Parasitología Las bebidas alcohólicas son el producto biotecnológico de mayor producción dentro de las empresas biotecnológicas. La fermentación alcohólica es probablemente el proceso biotecnológico más antiguo desarrollado por el hombre, existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años (García Garibay & López-Mungía Canales, 2004). Las bebidas alcohólicas han sido mejoradas por el hombre buscando características organolépticas adecuadas al gusto de los consumidores. Tradicionalmente, la búsqueda de mejores características organolépticas en las bebidas alcohólicas ha provocado la selección indirecta de las levaduras responsables de la fermentación. Actualmente el proceso de fermentación es totalmente controlado y la tendencia actual es a la mejora genética de las levaduras de manera directa mediante la aplicación de técnicas del ADN recombinante (Pretorius, 2000). Tanto en vinos espumosos como en la cerveza la espuma es una de las características sensoriales más importantes ya que es percibida por el consumidor desde el momento en que se sirve y posteriormente cuando se bebe (Evans & Bamforth, 2009; Martínez- Rodríguez & Pueyo, 2009). Las bebidas alcohólicas son sistemas multicomponentes que además de proteínas y alcohol contienen otras macromoléculas, muchas de ellas con actividad superficial por sí mismas o bien por interacción con otras. Por este motivo se han realizado estudios para determinar cuáles son los compuestos con mayor capacidad espumante en bebidas espumosas y se ha observado que en el caso de los vinos espumosos las macromoléculas con mayor capacidad espumogénica son las glicoproteínas (Senée et al, 1999; Moreno-Arribas et al, 2000; Douglas et al, 2005). Las glicoproteínas han sido identificadas como las macromoléculas dominantes en la espuma de los vinos espumosos, esto es debido a la naturaleza hidrófoba de las glicoproteínas, que favorece la unión de estas a las burbujas de gas, así, los glucanos hidrófilos de estas se localizarán en la capa acuosa entre la burbujas y la región hidrófoba correspondiente a la región proteica se situará hacia la cara interior de la burbuja, de manera que cuando la capa acuosa se hace más fina, éstas aumentan la viscosidad retardando el drenaje. De manera que los polipéptidos hidrófobos aumentan la tensión superficial de las burbujas aumentando la estabilidad de la espuma (Senée et al, 1999; Núñez et al., 2006). Así, es bien conocido que ciertas cepas de S. cerevisiae son capaces de flotar hasta la superficie del mosto en fermentación favoreciendo la formación y estabilización de la espuma. Esta capacidad de producir espuma en estas cepas ha sido atribuida a la capacidad de las proteínas de la pared celular, y sobre todo de las manoproteínas, para adherirse a las burbujas de CO2 (Chiavari et al., 2000). En los vinos espumosos la mayoría de las manoproteínas son liberadas durante la segunda fermentación y durante el proceso de envejecimiento que es cuando tiene lugar la autolisis de las levaduras (Gonçalves et al, 2002; Feuillat, 2003; Vuchot & Bajard- Sparrow, 2009). Durante la autolisis las glicoproteínas y los polisacáridos de la pared celular de las levaduras son hidrolizados por las glucanasas que actúan sobre enlaces de los glucanos de la pared celular liberando las manoproteínas que estaban enlazadas covalentemente a estos glucanos (Charperntier & Freyssinet, 1989; Martínez-Rodríguez & Pueyo; 2009). La presencia de proteínas de levadura en la cerveza se describió en diversos estudios en los que se caracterizaron las proteínas presentes en la cerveza. Mediante ensayos inmunológicos a partir de la espuma de la cerveza se detectó por primera vez la presencia de antígenos correspondientes a proteínas de levaduras, que tenían un tamaño entre 70000 y 120000 daltons y en otros estudios aparecían en las fracciones de 200000 daltons (Hejgaard & Sørensen, 1975; Mohan et al., 1992). La implicación de las levaduras en el mantenimiento de la espuma se estableció mediante ensayos en fermentaciones de mosto sintético donde se producía la espuma artificialmente, estos estudios concluyeron que las levaduras no contribuyen tanto la producción como al mantenimiento y la estabilización de la espuma en la cerveza (Kordialik-Bogacka & Campbell, 2000; Kordialik-Bogacka & Ambroziak, 2004; Douglas et al., 2006). Genes de levaduras implicados en la producción de espuma Kasahara et al. (1974) identificó por primera vez los genes de un cepa de sake de S. cerevisiae responsables del carácter espumante, a partir de ensayos de hibridación entre cepas no espumantes y cepas espumantes, así llegó a la conclusión de que este carácter debía estar determinado por al menos dos genes. Thornton (1978a,b), estudió el carácter espumante en una cepa vínica de S. cerevisiae, y mediante técnicas de hibridación de tétradas estableció que el carácter espumante estaba determinado dos genes, FRO1 y FRO2, situados a una distancia el uno del otro de 21 centimorgans en el cromosoma VII. Concluyó que eran dominantes y que eran genes no aditivos, de manera que aunque hubiese varias copias la cantidad de espuma obtenida era la misma. Además estableció que estos genes eran alélicos de otros dos genes presentes en las cepas de sake (Kasahara et al., 1974; Tornton, 1978a, b). Un nuevo gen implicado en la producción de espuma fue aislado a partir de la cepa de sake K7 de S. cerevisiae. Este gen llamado AWA1, codifica para la proteína Awa1p que ha sido clasificada como una manoproteína con punto de anclaje al GPI que confiere hidrofobicidad a la superficie celular, de manera que favorece el mantenimiento de la espuma al adsorberse a la superficie de las burbujas. La implicación de esta proteína en la espuma quedó demostrada cuando al deleccionar el gen se observaba que el nivel de espuma que se producía al fermentar era menor que cuando se utilizaba la cepa silvestre (Shimoi et al., 2002). Homotalismo y Heterotalismo Las levaduras se clasifican por su ciclo de vida como homotálicas o heterotálicas. Las células heterotálicas son de tipo conjugante estable, de manera que cuando se dividen por vegetativamente las células ¿ dan lugar a células ¿, y las células a dan lugar a células a. Solamente conjugan dos células de tipo opuesto para formar un diploide que por meiosis dará lugar a células haploides de ambos tipos conjugantes. En el caso de las células homotálicas, las células diploides esporulan dando lugar a cuatro esporas haploides, éstas se dividen por mitosis y la célula madre cambia su tipo conjugante fusionándose con la hija y dando lugar de esta manera a un nuevo diploide a/¿ (Herskowitz & Jensen, 1991). El gen responsable del homotalismo es el gen HO que codifica para una endonucleasa específica que es necesaria para el cabio de tipo conjugante (Herskowitz & Jensen, 1991). Objetivos - Obtención de cepas heterotálicas competentes para la conjugación a partir de la cepa vínica 145A211 de Saccharomyces cerevisiae y de la cepa cervecera Weihenstephan 34/70 de Saccharomyces pastorianus. - Identificación y estudio de los genes responsables de la producción de espuma en las bebidas fermentadas, presentes en la cepa vínica 145A211 de Saccharomyces cerevisiae y de la cepa cervecera Weihenstephan 34/70 de Saccharomyces pastorianus. Delección de los genes HO de S. cerevisiae y sc-HO de S. pastorianus. La heterotalización de la cepa 145A211 de Saccharomyces cerevisiae y de la cepa Weihenstephan 34/70 de Saccharomyces pastorianus, se diseñó un vector de interrupción del gen HO, al que se denominó pDHO. Este vector contiene un casete de interrupción que consiste en un fragmento HO1, de 80 pb, que se corresponde con 16- 96 pb del gen HO de S. cerevisiae y un fragmento HO2 de 137 pb, que se corresponde con 1572- 1654 pb del gen HO. El casete de interrupción Ho-loxPKanMXloxP se utilizó para transformar las cepas homotálicas y diploide en el caso de 145A211 de S. cerevisiae y poliploide Weihenstephan 34/70 de S. pastorianus. Los transformantes seleccionados resistentes a G418, eran diploides heterocigotos HO/ho::KanMX, y por lo tanto solamente en un cromosoma del par estaría el gen HO interrumpido, estos transformantes esporularon, de manera que una vez separadas las cuatro esporas se seleccionaron las que eran resistentes a G418, y para comprobar que ya no eran homotálicas se cultivaron en medio de esporulación comprobando así su incapacidad para esporular. Posteriormente se estableció el tipo conjugante de las células seleccionadas, para ello se cruzaron con cepas genéticas de tipo conjugante conocido, CSH84L (¿) y con la cepa CSH89L (a). Como las cepas derivadas de la 145A211 y de W 34/70 no presentan auxotrofías, la habilidad para conjugar se comprobó por su capacidad para producir zigotos y esporas. Finalmente para eliminar el casete de interrupción las cepas obtenidas fueron transformadas con el plásmido YEp351-Cre- Cyh. Al heterotalizar la cepa de S. cerevisiae 145A211 se obtuvo una cepa haploide de S. cerevisiae, a la que se denominó SC22. La heterotalización de esta cepa se demostró al comprobar su habilidad para conjugar con otras cepas, ya que de otro modo hubiese conjugado con su hija dando lugar a un diploide homotálico que siempre sería capaz de esporular. Lo mismo ocurrió con la cepa W 34/70 de S. pastorianus, aunque en este caso solo se interrumpió el gen Sc-HO, la cepa fue heterotalizada para dar lugar a una nueva cepa denominada SP1, lo que corrobora que con la eliminación de una de las copias es posible heterotalizar estas cepas, como referían en estudio previos en los que se interrumpió el gen Lg-HO. El nivel de ploidía de la cepa SP1 se redujo a la mitad y se hizo competente para conjugar con otras cepas. Tanto la reducción en el nivel de ploidía como la habilidad para conjugar hacen a estas cepas susceptibles de ser mejoradas bien por técnicas de ADN recombinante como por técnicas de selección clásicas. Estudio y análisis del gen responsable del carácter espumante en la cepa vínica 145A211 de Saccharomyces cerevisiae A partir de ensayos de microvinificación con 36 cepas vínicas silvestres espumantes de S. cerevisiae, se seleccionó la cepa 145A211 por ser la que producía la mayor cantidad de espuma y además la espuma más estable. A partir del ADN genómico de la cepa vínica 145A211, mediante PCR empleando los primers diseñados a partir de la secuencia del gen espumante AWA1 presente en la cepa fermentadora de sake K7, se amplificó y secuenció un nuevo gen de 2313 pb, que se denominó FPG1 (foam promoting gene) y cuya secuencia fue depositada en la base de datos GenBank con el código EU414028.1. A partir de la secuencia génica se obtuvo la secuencia de una una proteína de 770 aa y 72512.22 Da, y que presenta las características típicas de un precursor de manoproteínas. A partir del análisis de la secuencia proteica se observó que presentaba motivos típicos de las glicoproteínas presentes en la pared celular de las levaduras. Las regiones N-terminal y C-terminal son hidrófobas, contiene una péptido señal (residuos 1 al 24) y un posible punto de anclaje al glicerolfosfatoinositol (GPI) (residuo 749), también poseen una región rica en ser (residuos 29 al 480) que supone el 35,5% de los aa, una región rica en thr (residuos 470 al 716) que es el 18,2% de los aa, numerosos puntos de O-glicosilación, y dos puntos de N-glicosilación (residuo 28 y residuo 35). Una vez que este precursor de manoproteínas sufre las modificaciones postraduccionales, da lugar a la proteína Fpg1p, que tiene un tamaño de 726 aa y un peso de 67812.68. Los análisis de homología mostraron una elevada similitud con distintos genes y proteínas de la pared celular, que se correspondían con manoproteínas, y sobre todo con los genes HPF1 y AWA1, ambos codificantes para manoproteínas y productor de espuma en el segundo caso. El gen se localizó cromosómicamente mediante la técnica del Southern Blot y técnicas de mapeo mitótico por pérdida de cromosomas y mapeo meiótico Para realizar el Southern Blot se hizo un PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) de los cromosomas de la cepa 145A211, y la sonda empleada para marcarlos se obtuvo a partir de un fragmento de 1000 pb del gen FPG1. La cepa 145A211 es prototrófica, por ello para realizar el mapeo meiótico y el mitótico, fue necesario marcar el gen FPG1 de la cepa heterotálica SC22, para ello el gen se interrumpió con el casete de interrupción loxP-KanMX-loxP del vector pUG6, dando lugar a la cepa SCH2 ¿ho fpg1::KanMX, finalmente la cepa SCH2 se cruzó con otras cepas de S. cerevisiae con marcadores cromosómicos conocidos. Así, se pudo establecer que el gen FPG1 está ubicado en el cromosoma VII en la posición -119 cM del brazo izquierdo. Estudios fenotípicos de la proteína Fpg1p En primer lugar para poder realizar los estudios fenotípicos se obtuvo una cepa con el gen FPG1 deleccionado, a la que se denominó DHA2-16. Para obtener esta cepa la cepa silvestre 145A211 se transformó con el casete de interrupción loxP-KanMX-loxP del vector pUG6, y una vez obtenidos los transformantes con las dos copias del gen interrumpidas se transformaron con el vector YEp351-Cre-Cyh, con el que se eliminó el casete de interrupción obteniéndose así la cepa DHA2-16 ¿fpg1. Para determinar si la proteína Fpg1p está en la pared celular se hizo un ensayo de sensibilidad a la liticasa de las cepas 145A211 y DHA2-16. En los cultivos que crecieron durante 48h, la pared celular es más gruesa y contiene más ß-glucano por lo que se observó que la sensibilidad de la cepa 145A211 era casi la mitad que a las 12h y en el caso de la cepa DHA2-16 apenas es sensible a la liticasa. La diferencia en la sensibilidad entre ambas cepas, indicaba que la proteína está ubicada en la pared celular, ya que la liticasa contiene ß-glucanasas que rompen los enlaces de ß-glucano de la pared celular. Las células de ambas cepas teñidas con Calcofluor White, se observaron con un transiluminador observándose más brillo en el pocillo correspondiente a la cepa con el gen FPG1 deleccionado que en la cepa silvestre 145A211. Este resultado implica que en la cepa DHA2-16 la proteína Fpg1p ha sido sustituida por quitina. Otros ensayos fenotípicos mostraron los mismos resultados. Los ensayos de hidrofobicidad de la superficie se observó que la hidrofobicidad era mayor en la cepa 145A211 que en la cepa DHA2-16, lo que indica que la proteína confiere hidrofobicidad a las células y que por lo tanto debe estar relacionada con la estabilización de la espuma. Extracción de la proteína Fpg1 Las cepas 145A211 y DHA2-16 fueron cultivadas en presencia de tunicamicina, que inhibe la N-glicosilación de las proetínas. La proteína se extrajo mediante el tratamiento con liticasa de las paredes celulares. Una vez extraído el extracto proteico de ambas cepas se sometió a una electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida, obteniéndose una banda cercana a los 70 KDa en el carril correspondiente a la cepa 145A211 que no aparecía en el carril correspondiente a la cepa DHA2-16. Esta banda tiene el tamaño de la proteína Fpg1p tras haber sufrido las modificaciones postraduccionales. Implicación de Fpg1p en el fenotipo espumante Para establecer la implicación del la proteína Fpg1p en la producción de espuma se realizaron ensayos de microfermentación empleando como cultivo iniciador la cepa espumante 145A211 y la cepa DHA2-16. Se observó que tras 24h de fermentación la cantidad de espuma era mayor en los tubos correspondientes a las fermentaciones con la cepa 145A211 que en los tubos fermentados con la cepa DHA2-16. Aunque tras 48h la cepa DHA2-16 había producido algo más de espuma esta no se había mantenido, mientras que en la cepa 145A211 la espuma si se mantenía. Así se confirma que la proteína Fpg1p está implicada en la producción de espuma y en el mantenimiento de la estabilidad de la misma. Con la finalidad de establecer claramente la implicación de la proteína Fpg1p en la producción de espuma, el gen FPG1 se insertó en el vector de expresión de S. cerevisiae pYES2 (Invitrogen), y este vector con el gen FPG1 se clonó en la cepa de S. cerevisiae no espumante MI2B. La expresión del gen se indujo durante 48h en presencia de galactosa, una vez pasado este tiempo, las células se recuperaron y se emplearon para realizar ensayos de fermentación. Las fermentaciones se mantuvieron durante dos días, y se observó una clara diferencia en la producción de espuma entre los tubos fermentados con cepa control MI2B y los tubos fermentados con la cepa MI2B PYES2- FPG1, siendo mayor la cantidad en el segundo caso. Esto demuestra claramente que la proteína Fg1p es responsable de la producción de espuma en los vinos. Finalmente se realizó un ensayo de recuperación del fenotipo espumante que confirmó los resultados previos. Estudio y análisis del gen responsable del carácter espumante en la cepa cervecera Weihenstephan 34/70 de Saccharomyces pastorianus A partir del ADN genómico de la cepa cervecera Weihensephan 34/70 de Saccharomyces pastorianus, mediante PCR empleando los primers diseñados a partir de la secuencia del gen espumante AWA1 presente en la cepa fermentadora de sake K7, se amplificó y secuenció un nuevo gen de 3408 pb, que se denominó CFG1 (Carlsbergensis foaming gene) que fue depositado en la base de datos GenBank con el código EU414029.1. Este gen codifica para la proteína Cfg1p de 1136 aa y un peso molecular de 110985.69 Da, que presenta las características típicas de los precursores de manoproteínas, es decir, un péptido señal, un punto de anclaje al GPI, una región rica en serina, una región rica en treonina, está muy O-glicosilado y presenta cinco puntos de N-glicosilación. Los análisis de homología determinaron que era altamente homólogo al gen espumante AWA1 de la cepa de sake K7, además de presentar homología con otros genes codificantes de manoproteínas entre los que se incluyen HPF1 y el otro gen de S. cerevisiae descrito en este trabajo, FPG1. Al ser S. pastorianus un organsimo poliploide no se pudo realizar el mapeo meiótico pero si el mapeo mitótico mediante Southern Blot y pérdida cromosómica (Wood, 1982) estableciendo su ubicación en el cromosoma XV, al igual que el gen espumante AWA1. El Southern Blot se llevó a cabo hibridando una sonda que se correspondía con el gen CFG1 sobre los cromosomas de la cepa W 34/70 separados mediante PFGE. El mapeo meiótico se realizó mediante cruces entre la cepa heterotalizada SPH5, con el gen CFG1 interrumpido con el casete loxP-KanMX-loxP, y cepas genéticas de S. cerevisiae que presentaban marcadores conocidos. Estudios fenotípicos de la proteína Cfg1p En primer lugar se obtuvo una cepa con la delección del gen CFG1, a la que se denominó SPHA1b. Para ello la cepa W34/70 de S. pastorianus fue transformada con el casete de interrupción loxP-KanMX-loxP del vector pUG6. Los transformantes obtenidos contenían dos copias del gen interrumpidas, estos, se transformaron con el vector YEp351-Cre-Cyh, con el que se eliminó el casete de interrupción obteniéndose así la cepa SPHA1b ¿cfg1. Para establecer la ubicación de la proteína se realizaron ensayos de sensibilidad a la liticasa. Ser observó que la cepa silvestre era más sensible a la liticasa a las 12h que a las 48h debido al engrosamiento que sufre la pared durante el crecimiento. La cepa SPHA1b sin embargo, a las 12 h era más sensible que la cepa silvestre a la liticasa, sin embargo a las 48h apenas hay descenso en la densidad óptica, lo que sugiere que el espacio dejado por esta proteína está siendo ocupado por otro compuesto como la quitina que no es sensible a la liticasa. Los ensayos de hidrofobicidad de la superficie se observó que la hidrofobicidad era mayor en la cepa W 34/70 que en la cepa SPHA1b, lo que indica que la proteína confiere hidrofobicidad a las células y que por lo tanto debe estar relacionada con la estabilización de la espuma. Extracción de la proteína Cfg1p Las cepas W 34/70 y la cepa SPHA1b se cultivaron en presencia de tunicamicina para evitar la N-glicosilación de la proteína. Una vez alcanzada la densidad óptica adecuada se realizó la extracción de las proteínas de la pared celular por el método post-alcali. El extracto proteico obtenido se sometió a una electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida, observándose en la calle correspondiente al extracto proteico de la cepa silvestre W34/70 un banda de aproximadamente 105KDa, que es el tamaño aproximado de la proteína Cfg1p tras las modificaciones postraduccionales. En la calle correspondiente a la cepa sin la proteína Cfg1p, SPHA1b, no se observó ninguna banda de este tamaño. Estos resultados sugieren nuevamente que la proteína Cfg1p está situada en la pared celular. Estudio de la capacidad de producción de espuma de la proteína Cfg1p Las cepas W34/70 y SPHA1b se emplearon como inoculo de mosto cervecero para llevar a cabo estudios de la producción de espuma de estas cepas. Tras un día de fermentación ambas cepas producían la misma cantidad de espuma, sin embargo, tras dos días en el mosto fermentado con la cepa SPHA1b la espuma se había colapsado, mientras que en el mosto fermentado con la cepa silvestre se mantenía el mismo nivel de espuma. Este ensayo se realizó también en mosto de uva con los mismos resultados. Una vez finalizada la fermentación la estabilidad de la espuma en la cerveza analizó mediante el método de agitación y midiendo el nivel de espuma producido cada cinco minutos. Se observó que la espuma en la cerveza producida con la cepa SPHA1b se colapsaba más rápidamente que en la producida con la cepa silvestre. Estos resultados sugieren que el papel principal de la proteína Cfg1p en la producción de espuma en la cerveza es la estabilización de la misma. Finalmente se realizaron ensayos de sobreexpresión de la proteína. Para ello el FPG1 se clonó en el vector de expresión pYES2 (Invitrogen) y se transformó en la cepa de laboratorio de S. cerevisiae MI2B. La expresión del gen se indujo durante 48h en presencia de galactosa, una vez pasado este tiempo, las células se recuperaron y se emplearon para realizar ensayos de fermentación. Las fermentaciones se mantuvieron durante dos días, y se observó una clara diferencia en la producción de espuma entre los tubos fermentados con cepa control MI2B y los tubos fermentados con la cepa MI2B PYES2-CFG1, siendo mayor la cantidad en el segundo caso. Esto demuestra claramente que la proteína Cfg1p está implicada en el proceso de producción de espuma durante la fermentación de los mostos. Conclusiones - Se han heterotalizado la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae y la cepa cervecera Weihenstephan 34/70 de S. pastorianus. - Se ha conseguido cepas competentes para la conjugación a partir de la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae y de la cepa cervecera Weihenstephan 34/70 de S. pastorianus. - El gen FPG1 (Foam promoting gene) de la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae es un gen de 2313 pb que se encuentra localizado en el cromosoma VII de dicha cepa. - El gen FPG1 de la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae, codifica para una proteína de 771 aa y 72512.22 Da, denominada Fpg1p. - En la cepa Weihenstephan 34/70 se ha identificado un gen, CFG1 (Carlsbergensis foaming gene), de 3408 pb que se encuentra ubicado en el cromosoma sc XV de dicha cepa. - El gen CFG1 codifica para una proteína, Cfg1p, de 1136 aa y 110976,75 Da. - Tanto la proteína Fpg1p como la proteína Cfg1p son manoproteínas presentes en la pared celular de las levaduras. - Ni la proteína Fpg1p de la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae ni la proteína Cfg1p de la cepa cervecera Weihenstephan 34/70, intervienen en el metabolismo fermentativo de la célula. - El gen FGP1 de la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae y el gen CFG1 de la cepa cervecera Weihenstephan 34/70 de S. pastorianus son responsables del carácter espumante en cada caso. - Tanto la proteína Fpg1p como la proteína Cfg1p confieren estabilidad a la espuma. 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