Valoración y mejora de la extracción del genoma del VIH usando nanopartículas magnéticas

Resumo

El proceso de extracción de los ácidos nucleicos es un paso preliminar en todo el proceso diagnóstico molecular en el trabajo clínico con el VIH. Dicho proceso condiciona el flujo de trabajo y la respuesta de los distintos sistemas y plataformas que se usan con el VIH. Nuestro trabajo consistirá en establecer los parámetros de funcionamiento de los sistemas automáticos de extracción más frecuentemente utilizados. Para ello utilizaremos: -un estándar constituido por varias construcciones alternativas, generadas por mutaciones dirigidas sobre el plásmido pNL4.3, que tienen como base la estructura genómica del VIH-1 (en forma de plásmidos circulares o linearizados mediante corte común con Apa I); -viriones de VIH (el que comporta utilizar RNA en vez que DNA) que obtendremos tras transfección, de los plásmidos en células 293t/17 (excepto NL4.3 4634X que es un pseudotipo no infeccioso para CEM-GFP). De tal forma podremos estudiar el proceso de extracción valorando las concentraciones, purezas y la integridad de los ácidos nucleicos que se extraen tras elución desde los distintos sistemas y químicas empleados. La mayor parte de los sistemas automatizados en uso utilizan nanopartículas magnéticas (MNPs) y absorción inespecífica. Nuestra intención es desarrollar también nanopartículas alternativas estudiando sus propiedades de magnetismo, de forma que podamos conseguir lotes de partículas estándar que eviten variabilidad en nuestro trabajo con el VIH. Para la obtención de las mismas utilizaremos como recurso nuestra relación con Nanogap (www.nanogap.es). En este proyecto nos proponemos: -Síntetizar las nanopartículas (MNPs). Fabricaremos MNPs de MFe2O4, donde M = Mn, Fe, Co o Ni, así como, nanopartículas metálicas y bimétalicas de Fe, Co, CoPt, y FePt. Se procurará especialmente obtener una distribución monodispersa en tamaños (dentro del rango de 10-50 nm) y formas (esférica). Probaremos diferentes procedimientos: microemulsiones, precipitación frenada, métodos hidrotermales y electroquímico, con la idea de obtener un método final que permita un fácil escalado. -Recubrir las nanopartículas: (C@S NPs). Desarrollaremos diferentes materiales de cobertura: -Cubiertas Inorgánicas: Suelen tener buenas propiedades como la resistencia al calor y química, buena superficie y fuerza mecánica. Además sus dispersiones en medios biológicos son estables y evitan aglomerados. Por este motivo sintetizaremos y caracterizaremos dos tipos de cubiertas: silica y oro. -Cubiertas orgánicas: También probaremos dos tipos de cubiertas: polimeros/copolimeros y almidón. -Funcionalizar las nanopartículas. Funcionalizaremos dichas partículas para mejorar sus condiciones de estabilidad, absorción y protección frente a las nucleasas.