Alérgenos recombinantes de anisakis

Resumo

Con el objetivo de mejorar el serodiagnóstico de la anisakiosis se realizó el cribado de una genoteca de expresión de Anisakis simplex con el anticuerpo monoclonal UA3 para tratar de obtener en forma recombinante las proteínas reconocidas por dicho monoclonal. Este procedimiento permitió identificar la novedosa estructura primaria del alérgeno Ani s 7, que se caracteriza por la presencia de un elevado contenido de residuos de cisteína y la repetición en tándem del motivo CX17-25CX9-22CX8CX6. La obtención de un fragmento de 279 aminoácidos de dicho alérgeno en forma recombinante (t-Ani s 7) permitió el desarrollo de un ensayo ELISA indirecto para el diagnóstico de la anisakiosis (t-Ani s 7 ELISA) que conservaba la especificidad del ensayo precedente ELISA-UA3 pero aumentaba la sensibilidad. El polipéptido recombinante t-Ani s 7, que conserva el epitopo reconocido por el anticuerpo monoclonal UA3, fue empleado para caracterizar el alérgeno Ani s 7. La realización de experimentos de inhibición con péptidos sintéticos derivados de la zona de mayor homología de la secuencia de Ani s 7 permitió identificar el epitopo lineal de 18 aminoácidos que reconoce el anticuerpo monoclonal UA3 (MCQCVQKYGTEFCKKRLA). Mediante experimentos de inhibición empleando sueros de pacientes con anisakiosis se comprobó que dicho epitopo es un epitopo inmunodominante frente al que se dirigen la mayor parte (44-85%) de los anticuerpos generados frente a Ani s 7 durante la infección por el parásito. Además se comprobó que el epitopo es resistente al tratamiento con pepsina y al calentamiento hasta los 80ºC. La inoculación de ratas con larvas vivas y muertas de Anisakis simplex permitieron comprobar que solamente se generan anticuerpos frente al polipéptido recombinante t-Ani s 7 durante la infección activa del parásito, indicando que este polipéptido puede ser empleado para diferenciar las verdaderas infecciones de Anisakis de aquellos pacientes con anticuerpos IgE inducidos frente a antígenos con reactividad cruzada con antígenos del parásito. Asimismo, se comprobó que el alérgeno Ani s 7 es género específico, de manera que puede emplearse para diferenciar las infecciones de Anisakis y Pseudoterranova. Con el objetivo de comparar el valor diagnóstico del ensayo t-Ani s 7 ELISA con el de los principales métodos de serodiagnóstico de la anisakiosis, el alérgeno Ani s 1 fue obtenido en forma recombinante y empleado para desarrollar un ensayo ELISA indirecto. Para realizar la comparación de los dos ensayos ELISA con el método comercial InmunoCAP (Phadia) se probaron los sueros de 495 pacientes con síntomas clínicos de alergia alimentaria. Los resultados mostraron que el uso combinado de los polipéptidos rAni s 1 y t-Ani s 7 en ELISA indirecto optimiza el serodiagnóstico de la anisakiosis y que además puede emplearse para diferenciar las infecciones recientes de las infecciones pasadas. El ensayo ELISA indirecto con los antígenos recombinantes Ani s 1 y t-Ani s 7 fue empleado en un estudio epidemiológico de casos y controles realizado en tres hospitales españoles para analizar la relevancia de las infecciones previas por Anisakis como factor de riesgo de hemorragias digestivas altas. El análisis de los resultados demostró que una infección previa por el parásito es un factor de riesgo de hemorragias digestivas, principalmente cuando está asociado a otros factores de riesgo como la infección por Helicobacter pylori o el consumo de antiinflamatorios no esteroideos.