Detección y validación de marcadores de diagnóstico del derrame pleural maligno

Resumo

El derrame pleural (DP) es una acumulación de fluido en la cavidad pleural, indicativa del desarrollo de una enfermedad de tipo pulmonar, pleural o extrapulmonar. En nuestro caso, el derrame pleural maligno (DPM) (secundario a neoplasias de tipo epitelial o a carcinomas) es la manifestación de una enfermedad neoplásica de tipo metastásico en estado muy avanzado. Generalmente se relaciona con una supervivencia media corta y una elevada tasa de morbilidad y mortalidad. Es por este motivo que una investigación exhaustiva de los marcadores que ocasionan este tipo de patología, aparte de contribuir a mejorar el diagnóstico y pronóstico de los pacientes, permitiría la obtención de un seguimiento más adecuado de esta patología. En la actualidad, la forma menos invasiva, más rápida y eficaz de establecer el diagnóstico de malignidad es el examen citológico del líquido pleural y, pese a que varía en función del tipo de tumor, el porcentaje medio de DPM que se diagnostican mediante esta metodología ronda el 60 %. A pesar de que se han analizado numerosos procedimientos bioquímicos, genéticos e inmunológicos para intentar mejorar la sensibilidad en el diagnóstico, ninguno de estos métodos es, hasta la fecha, aplicable en la práctica clínica diaria. Y puesto que a día de hoy se emplean metodologías muy agresivas para el establecimiento de un diagnóstico, sería importante encontrar un método de valoración que fuese más cómodo, rápido y preciso, y que permitiese evitar la realización de procedimientos agresivos como la biopsia pleural o biopsia por toracoscopia. En el ámbito de la investigación biomédica, la búsqueda de marcadores mediante el empleo de metodologías proteómicas ha dado origen a resultados bastante prometedores, por lo que en esta Tesis Doctoral se han empleado este tipo de metodologías para detectar proteínas con utilidad clínica para el diagnóstico del DPM, y además se ha procedido a la posterior validación de las proteínas consideradas como candidatas a marcadores de la patología. En un primer momento se ha llevado a cabo un estudio proteómico de expresión diferencial con el objetivo de identificar y cuantificar proteínas que presentaban un nivel de expresión alterado como consecuencia del estado patológico. Como primer paso se empleó una estrategia que consiste en el uso de un método de prefraccionamiento de la muestra previo a la separación electroforética. Este método nos permitió enriquecer la muestra en un grupo de proteínas de interés, que en nuestro caso estaría compuesto por proteínas que aparecían de forma minoritaria en las muestras de DP, consiguiéndose una mejora en la resolución de los mapas, y pudiéndose detectar un mayor número de proteínas, incluyendo las denominadas proteínas de baja abundancia, que presentan especial relevancia en el descubrimiento de nuevos marcadores tumorales y dianas terapéuticas. Para iniciar la búsqueda de proteínas candidatas a marcadores de diagnóstico utilizamos la tecnología de electroforesis diferencial en gel (DIGE), que está basada en la electroforesis bidimensional, pero en este caso es una técnica de tipo multiplex en la que múltiples muestras marcadas con diferentes fluoróforos migran en un mismo gel. Tras el análisis estadístico de los mapas proteicos obtenidos mediante esta tecnología pudimos saber qué especies proteicas presentaban variaciones significativas entre las muestras a estudio, que serían posteriormente identificadas mediante espectrometría de masas (MS). Una vez realizado el análisis de los mapas proteicos y la identificación de las proteínas cuya expresión variaba entre la patología maligna y benigna del derrame, pudimos seleccionar aquellas proteínas que por sus características y sus funciones podían ser consideradas potenciales candidatas a marcadores del DPM. Además, se corroboró que la metodología empleada en este trabajo era adecuada como herramienta para abordar la búsqueda de biomarcadores, ya que algunas de las proteínas cuya expresión se encontraba alterada en DPM habían sido propuestas previamente como candidatas a marcadores tumorales para las patologías que ocasionaban el derrame. Las especies proteicas que fueron seleccionadas para su validación como marcadores del DPM en esta tesis fueron sometidas a estudios de Western Blot e inmunoblot, para comprobar la alteración observada mediante la metodología DIGE, y a una posterior cuantificación proteica mediante el empleo de ELISAs específicos para cada una de las proteínas. Como primera proteína seleccionada como marcador se consideró al factor derivado del epitelio pigmentado (PEDF por su nombre en inglés Pigment epithelium-derived factor), cuyo patrón de expresión de las dos isoformas observadas en los geles DIGE permitía una clara separación entre el DPM y derrame pleural benigno (DPB). El PEDF es una glicoproteína que presenta una gran capacidad anti-angiogénica, mucho mayor que cualquier otro factor conocido de producción endógena. Por eso se procedió a comprobar la alteración de estas isoformas mediante Western Blot en una y dos dimensiones. Pese a que mediante la metodología DIGE ambas isoformas presentaban un ascenso en su expresión en pacientes con patología maligna, en los mapas monodimensionales apenas había diferencias entre los dos tipos de patologías, y en los mapas bidimensionales se detectaron diversas isoformas de masa molecular (Mr) y punto isoelétrico (pI) característico. El empleo de la metodología ELISA no ayudó a verificar los resultados puesto que existen múltiples isoformas cuya concentración hace que se enmascaren unas a otras a la hora de cuantificar la concentración total de la proteína. Las otras proteínas candidatas fueron la S 100 A8 y S 100 A9, que son dos proteínas que presentan un gran potencial como marcadores tumorales y dianas terapéuticas del cáncer. Además, también están implicadas en reacciones inflamatorias. Tanto la proteína S 100 A8 como la proteína S 100 A9 presentaban un patrón de expresión disminuido en los pacientes con patología maligna cuando se analizaron mediante metodología DIGE. Aunque en un principio se decidió realizar su análisis mediante Western Blot por separado para valorar su expresión, el análisis de la concentración se decidió hacer en conjunto, teniendo en cuenta la particularidad que presentan ambas proteínas de formar el dímero denominado calprotectina. El análisis mediante inmunoblot de la proteína S 100 A9 reveló la existencia de una mayor concentración de proteína en los pacientes con DPB en relación a aquellos que presentaban DPM, lo que confirmaría los resultados del DIGE. Debido a que las diferencias estaban tan claras, se decidió realizar el ELISA de la calprotectina (dímero formado por las proteínas S 100 A8 y S 100 A9) directamente, sin haber realizado inmunodetección previa de la proteína S 100 A8, suponiéndose que se detectaría la proteína de la misma manera que se había detectado la S 100 A9. Después de realizar las determinaciones bioquímicas se compararon las concentraciones de la calprotectina en distintos tipos de muestras cedidas por el Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI). Para el análisis de los resultados se emplearon pruebas de significación bilateral con un límite de significación estadística p < 0,05, obteniendo un resultado significativo (p = 0,001) a la hora de clasificar a los pacientes con DPM de aquellos con DPB, con una probabilidad estadística del 95 %. La elaboración de curvas ROC (Receiver-Operating Characteristic) permitió la obtención de un punto de corte con el que se obtenía la mayor eficiencia diagnóstica (545 ng/mL), y otro con el que se obtenía la mayor sensibilidad (736,4 ng/mL). Además, estos resultados permitían un diagnóstico clínico casi perfecto a la hora de clasificar a los pacientes entre DPM y DPB. A modo de conclusión, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han demostrado la utilidad y efectividad de la metodología empleada para llevar a cabo un estudio proteómico dirigido a la búsqueda de nuevos marcadores biomoleculares para el DPM. Entre las proteínas cuya expresión se encontró alterada y de las que se realizó un estudio en profundidad, consideramos que la proteína calprotectina podría ser de utilidad en clínica, y en concreto, ser utilizada como marcador complementario a la citología del fluido pleural.