Evaluación de la actividad del resveratrol como agente antiprotozoario frente a Philasterides dicentrarchi y como modulador de la respuesta inmunitaria innata del rodaballo

Resumen

P. dicentrarchi es un parásito histiófago que produce infecciones sistémicas e invade los órganos del rodaballo, causando importantes pérdidas en el sector de la piscicultura de este pez plano de alto valor comercial y en la que Galicia es líder de producción en nuestro país y en Europa. Hasta el momento no se dispone de medidas terapéuticas de control eficaces frente a este ciliado; por otro lado, la legislación vigente de la Unión Europea es muy restrictiva a la hora de permitir la utilización de fármacos de síntesis química para el empleo en el tratamiento de enfermedades en piscicultura. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio observamos que el RESV, una fitoalexina polifenólica, presentaba efecto antiparasitario sobre P. dicentrarchi in vitro; sin embargo, hasta el momento se desconoce su mecanismo de acción. Conocer como el RESV ejerce esta actividad frente a P. dicentrarchi es de gran interés, no solo por el posible uso de esta sustancia como antiparasitario sino también para establecer nuevas dianas terapeúticas a la hora de diseñar futuros fármacos frente a esta enfermedad. En el agua de mar, los escuticociliados ocupan la oxiclina (rango de pO2 entre 0-40%) considerándose organismos microaerófilos que crecen en ambientes hipóxicos. La capacidad de estos ciliados para desarrollar adaptaciones respiratorias que les permitan sobrevivir en ambientes hipóxicos (como podrían considerarse los tejidos del hospedador), podría tener un importante valor adaptativo para transformarse en organismos parásitos. Por otra parte, dado que el RESV se ha considerado como un agente antioxidante o prooxidante, dependiendo de la concentración y de las condiciones experimentales, sería interesante determinar cómo le afecta al parásito cuando éste se cultiva en diferentes concentraciones de oxígeno. Como ya se ha descrito en esta memoria, el RESV, un producto de origen natural, posee una importante capacidad antiinflamatoria en mamíferos. La reacción inflamatoria es de enorme importancia a la hora de combatir la infección, especialmente durante las primeras fases de la misma; sin embargo, cuando esta respuesta no es eficazmente regulada o se mantiene de forma crónica, puede generar efectos inmunopatogénicos que pueden ser deletéreos para el hospedador. Dado que, como ya se ha indicado anteriormente, el RESV es tóxico para el ciliado pero también, en caso de que sus efectos en peces fueran similares a los de mamíferos, podría modular procesos inflamatorios que están asociados a la escuticociliatosis en el rodaballo, parece relevante profundizar en el estudio de ambos aspectos para lograr en el futuro un control integral eficaz de esta patología. Basándonos en estas premisas nos hemos planteado los siguientes objetivos: 1. Investigar los mecanismos involucrados en la actividad antiparasitaria del RESV sobre P. dicentrarchi, determinando los cambios en el crecimiento celular así como las alteraciones morfológicas y metabólicas que se producen en el ciliado. 2. Evaluar los efectos del RESV sobre P. dicentrarchi cultivados en ambientes con distintas concentraciones de oxígeno. 3. Analizar los efectos del RESV sobre componentes de la respuesta inflamatoria en rodaballo, dedicándole especial atención a la funcionalidad de los leucocitos. Las principales conclusiones obtenidas de esta tesis doctoral fueron: 1.El RESV puede tener un efecto citostático o citotóxico en P. dicentrarchi dependiendo de la composición del medio de cultivo y de la disponibilidad de nutrientes. En presencia de nutrientes, el RESV causa una inhibición del crecimiento in vitro de P. dicentrarchi, provocando vacuolización y cambios en el tamaño. Los ciliados más pequeños presentan una actividad celular reducida, mostrando un estado similar a la criptobiosis. 2. EL RESV provoca cambios en el perfil polipeptídico de las proteínas de membrana pero no afecta a la producción de proteasas ni a la expresión de los genes de la ß-tubulina ni de la pirofosfatasa inorgánica. 3. El RESV daña las mitocondrias del ciliado e induce un intenso proceso de autofagia pero sin provocar apoptosis. 4. La respiración celular aeróbica en P. dicentrarchi es sensible a los inhibidores típicos de los complejos respiratorios mitocondriales, aunque presenta una resistencia parcial a la inhibición por cianuro. La respiración es también parcialmente inhibida por inhibidores de oxidasas alternativas. El RESV provoca una inhibición total de la respiración celular aeróbica, altera el potencial de membrana mitocondrial, induce un incremento en la producción celular de ROS y modifica la actividad de enzimas detoxificantes del ciliado. 5. P. dicentrarchi se comporta como un organismo microaerófilo capaz de crecer en medios hipóxicos. El RESV inhibe el crecimiento del ciliado tanto en condiciones normóxicas como hipóxicas. Otros inhibidores de la respiración como la antimicina también inhiben el crecimiento del ciliado, aunque en mucha menor medida que el RESV, y el cianuro no tiene efectos sobre el crecimiento. Por el contrario, el ciliado es sensible a la acción del propil galato, un inhibidor de la oxidasa alternativa de algunos organismos. 6. El RESV produce una importante modulación de la actividad de leucocitos del rodaballo, bloqueando procesos implicados en la respuesta innata e inflamatoria, como la migración celular, el estrés oxidativo y la síntesis de prostaglandinas. Además, este polifenol es un potente inhibidor de la actividad y expresión de la mieloperoxidasa de los leucocitos del pez.