Estudio del impacto de la dimerización y de variantes polimórficas en la farmacología y función de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) relevantes en esquizofrenia

Resumo

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) regulan múltiples procesos fisiológicos y son diana de muchos de los fármacos empleados en terapéutica. En la esquizofrenia, los receptores de serotonina 5-HT2A son una diana principal de fármacos antipsicóticos atípicos. Estos receptores son GPCRs capaces de formar homodímeros así como heterodímeros con otros GPCRs relevantes en la patología. La homodimerización es un aspecto poco conocido de la farmacología de los GPCRs, tanto en términos estructurales como de sus posibles consecuencias funcionales. En el presente trabajo hemos abordado un estudio de la interfaz dimérica del receptor 5-HT2A mediante dos estrategias complementarias. Primeramente, y en base a datos de modelización computacional resultantes de un proyecto colaborativo, se mutaron puntualmente distintos aminoácidos ubicados en diferentes posibles interfaces de homodimerización del receptor, para a continuación evaluar el efecto de estas mutaciones sobre la capacidad de homodimerizar del receptor. Esto se llevó a cabo en células transfectadas mediante la técnica de BRET (bioluminescence resonance energy transfer), puesta a punto con este propósito. En paralelo, se investigó la posible relevancia de la interacción colesterol-5-HT2A sobre la dimerización del receptor, empleando una aproximación bioquímica de extracción del colesterol membranal combinada con la mutación de un aminoácido perteneciente al motivo consenso de unión con colesterol del receptor. Los resultados apuntan a la posible participación de distintos aminoácidos y/o interfaces en la interacción homodimérica, con contribuciones poco significativas de residuos individuales. También en el campo de la dimerización de GPCRs, se viene constatando la utilidad de ligandos fluorescentes y ligandos inactivadores irreversibles de GPCRs como herramientas químicas para la detección y estudio de dímeros receptoriales en tejidos nativos. En este ámbito, hemos llevado a cabo una caracterización farmacológica de ligandos fluorescentes de receptores 5-HT2 así como de ligandos inactivadores irreversibles de receptores 5-HT7, como herramientas novedosas en desarrollo en el marco de dos proyectos colaborativos. Estos estudios condujeron a la identificación de un ligando fluorescente que permitió la visualización de marcaje específico de receptores 5-HT2 en líneas celulares mediante microscopía de fluorescencia. Asimismo, un análisis estructura-actividad de los resultados de ensayos de unión de radioligando siguiendo protocolos para la identificación de compuestos pseudo-irreversibles, sobre una serie de ligandos arilpiperazínicos del receptor 5-HT7, evidenció la importancia de la lipofilicidad del ligando para su interacción pseudo-irreversible con el receptor. Dentro de la complejidad de la patología de la esquizofrenia, distintas evidencias apuntan a una base etiopatológica inmuno/inflamatoria. La quimiocina fractalquina (CX3CL1) y su receptor CX3CR1, de tipo GPCR, son clave en la comunicación neurona/glía y en la respuesta inmuno/inflamatoria, habiéndose identificado variantes polimórficas del receptor asociadas a distintas enfermedades, incluyendo una variante descrita como alterada en su conformación dimérica. Nosotros hemos abordado un estudio del posible impacto de los polimorfismos y la dimerización sobre la función del receptor CX3CR1, investigando la interacción de sus distintas variantes polimórficas con las proteínas reguladoras de GPCRs y moduladoras de vías de señalización independientes de proteína G β-arrestina 1, β-arrestina 2 y GRK2. Los resultados indican que una variante polimórfica del receptor asociada a patologías y que presenta una conformación dimérica alterada, interacciona de forma más eficiente que la variante receptorial salvaje con estas proteínas.