Estudios de señalización e inhibición de receptores ITAM en plaquetasbúsqueda de nuevos antiagregantes plaquetarios

Resumen

El papel de las plaquetas en el mantenimiento de la hemostasia se describió hace ya más de un siglo, pero en los últimos años se han llevado a cabo numerosos estudios que han confirmado su participación en múltiples procesos fisiológicos y patológicos. Por tanto, un profundo conocimiento de los eventos moleculares involucrados en la regulación de la función plaquetaria se hace cada vez más necesario, y su modulación farmacológica cobra un especial interés en el manejo de diversas patologías. La glicoproteína VI (GPVI; receptor de colágeno) y el receptor lectina tipo c 2 (CLEC-2; receptor de podoplanina) se expresan en la superficie de las plaquetas, donde participan en el desarrollo de diversas respuestas fisiológicas y patológicas en las que estas juegan un papel fundamental. La estimulación de estos receptores induce la fosforilación de los denominados motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM), que conduce a la amplificación de la señal a través de una cascada de tirosina-quinasas, la cual culmina con la activación plaquetaria. El receptor CLEC-2 fue descubierto hace poco más de una década, por lo que todavía queda mucho por conocer de los eventos intracelulares que suceden a su estimulación. Para descifrar la vía señalización acoplada a este receptor en detalle, en esta tesis se realizó un estudio del fosfoproteoma en tirosina de plaquetas, en el que se identificaron nuevas proteínas y lugares de fosforilación relevantes para la activación plaquetaria a través de CLEC-2. Además, se evaluó el impacto del ADP y el TXA2 sobre la cascada de señalización de este receptor, demostrando que estos mediadores son esenciales para alanzar los niveles óptimos de fosforilación de proteínas fundamentales para la función plaquetaria. Los resultados de este estudio han permitido elaborar una propuesta detallada del signalosoma de este receptor, en el que se incluyen por primera vez proteínas que podrían presentar interés en la modulación de la respuesta plaquetaria. Las balsas lipídicas son dominios de membrana que parecen ser fundamentales en diferentes procesos de señalización celular, incluyendo la activación plaquetaria inducida por CLEC-2 y GPVI. Por este motivo, en la presente tesis se planteó realizar un estudio proteómico de estos dominios en plaquetas, con el fin de esclarecer su papel en los eventos de señalización que suceden a la estimulación de estos receptores. Así, se determinó que las balsas lipídicas se encuentran relativamente enriquecidas en ciertas proteínas esenciales para la activación plaquetaria tras la estimulación de CLEC-2 y GPVI. Por otro lado, se observó una importante asociación entre estos dominios y proteínas citoesqueléticas en plaquetas en reposo, la cual se pierde tras la activación plaquetaria, lo que podría contribuir al enriquecimiento de las balsas lipídicas en proteínas de señalización que podrían presentar interés en la regulación de la respuesta plaquetaria a mediada por CLEC-2 y GPVI. En un último apartado de la tesis, se pretendió avanzar en el desarrollo de nuevos antiagregantes centrados en la modulación del receptor GPVI, el cual está considerado como una de las dianas más prometedoras en el campo de la farmacología plaquetaria. Para ello, se realizó una búsqueda de pequeñas moléculas capaces de inhibir el receptor a nivel de la superficie plaquetaria, así como su vía de señalización. De este modo, se identificaron dos potenciales inhibidores de GPVI, el SIL-ENA y el SEDN2, los cuales mostraron capacidad para reducir la agregación plaquetaria con un perfil compatible con la inhibición específica de este receptor, por lo que presentan gran potencial para ser desarrollados como nuevos fármacos antiagregantes plaquetarios. Además, se determinó que el CAL-101, inhibidor selectivo de la subunidad p110δ de PI3K, exhibe una actividad inhibitoria preferente sobre la vía de señalización acoplada a GPVI. En resumen, esta tesis doctoral incluye un exhaustivo análisis de los eventos de señalización que tienen lugar tras la activación del receptor CLEC-2 en plaquetas, así como de la relevancia de las balsas lipídicas en el proceso de activación plaquetaria mediada por CLEC-2 y GPVI. Los resultados obtenidos en ambos estudios podrían llevar a la consideración de ciertas proteínas como dianas prometedoras para la modulación de la respuesta plaquetaria a través de estos receptores. Además, se han identificado pequeñas moléculas con potencial para ser desarrolladas como fármacos antiagregantes plaquetarios centrados en la modulación de GPVI, tanto a nivel de la superficie plaquetaria como actuando sobre su cascada de señalización.