Combinación de terapias celulares para la reparación de lesiones de cartílago

Resumo

A cartilaxe articular humana vese afectada por varias enfermidades reumáticas como a osteoartrosis (OA) e ten unha capacidade de rexeneración moi limitada. As terapias celulares con células estaminais mesenquimais (CSMs) e condrócitos articulares (CAs) representan un campo esperanzador na medicina reparadora da cartilaxe. A seguinte tese é un compendio de investigacións deseñadas para entender mellor os procesos que levan á degradación deste tecido e, sobre todo, para desenvolver diversas estratexias para unha mellor e máis eficaz reparación do mesmo no futuro. No primeiro estudo, foi examinado o efecto sobre-expresión de lamina A (LMNA) ou a súa variante mutante proxerina (PG) sobre o potencial de diferenciación das CSMs procedentes de cordón umbilical humano (CU). A acumulación de lámina A (LMNA) foi previamente asociada ó fenotipo de condrócitos artrósicos (OA). As mutacións nesta proteína están ligadas a laminopatias e, especialmente, ó síndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS), unha enfermidade de envellecemento acelerado. Algúns autores suxeriron que a desregulación da LMNA afecta o potencial de diferenciación das células estaminais. O noso conxunto de resultados mostra que o potencial condroxénico é defectuoso en células que sobre-expresan PG (PG-CSMs), e que as transduzidas con lámina A (LMNA-CSMs) presentan un aumento nos marcadores de hipertrofia durante condroxénese. Ambas liñas mostraron unha diminución de manganeso superóxido-dismutasa (MnSODM), e cambios na súa capacidade migratoria. Por último, os defectos na condroxénese foron parcialmente revertidos coa incubación periódica cun axente de eliminación de ROS. Os nosos resultados indican que a sobre-expresión de LMNA e PG produce defectos no potencial de diferenciación condrogénica, en parte, debido a un desequilibrio no estrés oxidativo. No segundo estudo, investigouse unha posible mellora nos medios condroxénicas actuales para CSMs-CU. O obxectivo era determinar se as hormonas prolactina (PRL) e 3,3'-5-triiodo-L-tironina (T3), a hormona activa da tiroide, modula a condroxénese no noso modelo in vitro, e se a vía de sinalización Wnt toma parte na referida modulación. As CSMs-CU sometéronse a condroxénese usando un sistema de esferóides. A adición de T3 no medio condroxénico aumentou a expresión de xenes ligados á condroxénese como Col2, integrinas alfa-10 e beta-1 (ITGα10, ITG β 1) e SOX9, segundo a análise por qPCR. Os niveis de COL2, e ACAN analizados por inmuno-histoquímica e tintura con safranina O aumentaron tras 14 días de condroxénese en esferoides con T3, en comparación cos esferóides sen T3 ou con PRL. A expresión de β -catenina, a GSK-3β Frizzled e foron significativamente maiores nos esferóides cultivados con T3. Tales melloras inhibíase cando as células foron tratadas con T3 máis ML151, un inhibidor do receptor esteroideo de T3. Este traballo demostra, por primeira vez que T3 promove a diferenciación condrogénica no noso modelo in vitro, e esta diferenciación é mediada polo receptor de esteroides coactivator (SRC2). No terceiro estudo, xeramos células modificadas xeneticamente, capaces de resistir o proceso de inflamación por supresión do receptor da interleucina 1. As citocinas pro-inflamatorias, como IL-1 β son elevados en tecidos enfermos ou feridos e promoven a rápida degradación do tecido, evitando ademáis a diferenciación de células estaminais. Debido a esto as células inmunes aos seus sinais poden representar unha estratexia útil en terapia celular. Condrócitos articulares humanos (CAs) e células estaminais mesenquimais foron xenéticamente editadas mediante o sistema CRISPR-Cas en combinación con un vector deseñado para silenciar o receptor de IL-1 β (IL-1R1). As células foron estimuladas con IL-1β e TNFα en monocapa para avaliar a resposta inflamatoria nas células IL-1R1-KO. A condroxénese realizouse en discos de alxinato con medio condroxénico sen e con IL-1β. Leváronse a cabo análises de qPCRs e western- blot para investigar a expresión dos ARNm e proteínas nas células resistentes a IL1R1. A expresión do xen IL1R1 foi significativamente reducida nas células modificadas. A adición de IL-1β non aumentou a expresión de IL-1B, IL-6 e IL-8 nas células IL-1R1-KO mentres que so o fixo nas células control non editadas. Os estudos de diferenciación condroénica indican que as células de IL1R1-KO en presenza de IL-1β atinxen un nivel de diferenciación/rediferenciación equivalente ou similar ós cos controis en ausencia de IL-1β, e mostraron un aumento significativo na expresión de xenes SOX9 , ACAN e COL2A1. En presenza de IL-1β, as células control aumentaron á expresión dos xenes IL-6 e IL-8, mentres a transcrición e síntese de SOX9, ACAN e COL2A1 foi bloqueada. En contraste, a IL-1B, IL-6 e IL-8, non aumentou nas células IL-1R1-KO, e o efecto inhibidor de IL-1β en SOX9, ACAN e COL2A1 foi suprimido por completo. O cuarto estudo é un modelo animal en primates. Estudouse o proceso de migración espécifica de CSMs de membrana sinovial dende o torrente sanguíneo ás articulacións danadas. Inxectamos intravenosamente e directamente na articulación unha poboación de CSMs positivas para o marcador de superfície CD105 (CD105+-CSM). As células marcáronse con oxacarbocyanine (DIO) cando eran inxectadas por vía intravenosa (IV) ou octadecilo (C18) indocarbocianina (DII), cando a inxección era intra-articular (IA) directamente ao xeonllo, para seguir os seus movementos e situación través dos animais. Os animais utilizados foron Macaca fascicularis adultos ós que provocóuselles unha lesión no xeonllo esquerdo para crear un modelo animal osteoartrósico (OA). O xeonllo dereito foi usado como control. As células CD105 + marcadas inxectaronse dúas veces cun intervalo dunha semana. Os animais foron sacrificados un mes despois do tratamento. O análise inmunohistoqumico de diferentes órganos: bazo, corazón, graxa, fígado, intestino, páncreas, pulmón, músculo esquelético e ril revelaron que as CD105 +-CMM migrado cara á articulación danada. Algunhas células marcadas foron atopados nos nódulos do bazo, pulmón, fígado e nódulos linfáticos. Non se atoparon teratomas. Apareceu un aumento significativo de CSM nativas no xeonllo lesionado frente ó sano. As células CD105+-CMM foron negativas para CD68 e a zona onde se atoparon mostrou un aumento de SDF-1 en comparación co xeonllo saudable. Este estudo foi validado por inxección de células macadas con GFP e os resultados foron semellantes. Concluímos que a poboación CD105+-CSM foi reclutada polo xeonllo danado e que pode ser unha alternativa segura para a terapia celular en patoloxías claramente situadas coma a OA de xeonllo.