Structural characterization of the β-galactosidase from "Kluyveromyces lactis" and expression and directed evolution of β-galactosidases with high biotechnological interest

Resumo

Las ß-galactosidasas son enzimas hidrolasas que catalizan la hidrólisis de ?-galactósidos en sus monosacáridos correspondientes. Debido a esta capacidad, estas proteínas son muy importantes en las industrias alimentaria, farmacéutica y clínica. En esta tesis, la ß-galactosidasa de K. lactis fue clonada en una cepa de Saccharomyces cerevisiae, expresada, purificada y cristalizada. Su estructura en estado libre y la su complejo con el producto galactosa fueron determinadas a 2,75 y 2,8 Å, respectivamente. La ß- galactosidasa de K. lactis está organizada en 5 dominios en un patrón que está conservado en otras enzimas procariotas de la familia GH2, aunque presenta dos inserciones largas en los dominios 2 (264-274) y 3 (420-443) que son únicas y parecen estar relacionadas con su oligomerización y especificidad. El tetrámero de la ß-galactosidasa de K. lactis está formado por un par de dímeros, presentando una mayor energía de disociación la forma de dímero que su forma tetramérica, lo que puede explicar el por qué existe un equilibrio en solución entre la forma dimérica y tetramérica de la enzima. Por otro lado, se ha construido, expresado y caracterizado una ß-galactosidasa híbrida entre las ß-galactosidasas de K. lactis - Aspergillus niger. La proteína híbrida entre las ß-galactosidasas de K. lactis - A. niger aumenta el rendimiento de la proteína secretada al medio y las modificaciones introducidas en la construcción le han conferido características bioquímicas de interés biotecnológico. Se estudió además la producción de esta proteína híbrida en un cultivo continuo inmovilizado utilizando "spent grains" (un subproducto de la industria cervecera) como material de inmovilización en un fermentador tipo "Airlift". Finalmente, se estudió la expresión y producción de la ß-galactosidasa de A. niger en una cepa de S. cerevisiae, y se usaron técnicas de evolución dirigida para modificar el pH óptimo de la proteína hacia un pH más neutro.