Efectos de los fungicidas de nueva generación sobre el proteoma de levaduras fermentativas y el metaboloma fenólico con influencia en el color de vinos tintos

Resumo

El vitivinícola es uno de los sectores socio-económicos más importantes de España, siendo uno de los más rentables dentro de la industria agro-alimentaria. España es uno de los países con mayor producción y superficie de cultivo dedicada a viñedo a nivel mundial. La rentabilidad de este sector presenta una gran variabilidad entre campañas porque, entre otras cosas, es muy dependiente de la climatología. Uno de los factores ligados al clima que puede originar importantes pérdidas económicas en el sector vitícola es la aparición de enfermedades fúngicas. Estos patógenos se dispersan por medio del viento o el agua y germinan en condiciones favorables de humedad y temperatura. El medio de protección más eficaz contra estas enfermedades es el químico, mediante el empleo de fungicidas. La aplicación de estas sustancias en campo, aunque necesaria, se debe realizar siguiendo buenas prácticas agrícolas con el fin de limitar la presencia de residuos en las uvas en el momento de la vendimia. Otro aspecto importante para el sector, es la obtención de vinos diferenciados y de calidad. Sin duda, el color de un vino es una de las propiedades organolépticas más apreciadas por el consumidor. Esta característica depende en gran medida de la composición fenólica del vino, especialmente de su contenido en antocianinas en un vino joven. Los polifenoles son un grupo muy diverso de metabolitos secundarios de las uvas que pasan al vino por difusión durante el proceso de vinificación. Además, la rentabilidad del sector depende también de la progresión de la fermentación alcohólica, que a su vez está ligada a la viabilidad de las células de levadura. Cualquier modificación en el medio fermentativo puede ocasionar retrasos o incluso, en el peor de los casos, paradas fermentativas. Por todo lo expuesto, y debido a su importancia para la obtención de un vino de calidad, ambos aspectos deben ser controlados. En este sentido, la aplicación de fungicidas, aunque necesaria, podría ser un condicionante y llegar a comprometer la calidad del producto final. Así, el empleo de fungicidas podría afectar a la biosíntesis de compuestos fenólicos durante el crecimiento de la uva y a su posterior extracción durante el proceso de vinificación. Además, los fungicidas podrían también ocasionar cambios en la expresión proteica de las levaduras que se traducirían en cambios en su metabolismo y, por lo tanto, en alteraciones del curso fermentativo. La presente Tesis Doctoral se estructura en dos grandes bloques con el objetivo de profundizar en el conocimiento de las repercusiones que el uso de fungicidas tiene sobre la calidad organoléptica del vino, concretamente sobre su contenido en compuestos fenólicos y color, así como en el metabolismo de las levaduras encargadas de llevar a cabo la fermentación. En el primer bloque se evaluó el efecto de los fungicidas sobre el perfil fenólico y el color de vinos tintos monovarietales. Para ello, se llevaron a cabo diferentes procesos de vinificación en ausencia y presencia de diversos fungicidas (a distintos niveles de concentración y evaluando también la sustancia activa frente al producto comercial) y empleando diferentes variedades de uva tinta procedentes de distintas regiones de España. Se emplearon diferentes métodos analíticos para la extracción, identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos por cromatografía líquida, así como para la caracterización del color de los vinos mediante la determinación de diferentes parámetros espectrofotométricos. Los resultados ponen de manifiesto que la aplicación de fungicidas puede alterar el perfil fenólico y, por tanto, el color de los vinos. Estos cambios dependen en gran medida de la variedad de uva utilizada, así como de otros factores como el tipo de levadura encargada de la fermentación. Los fungicidas que más afectaron al contenido en polifenoles de los vinos analizados fueron mepanipirim y la mezcla boscalid+kresoxim-metil, afectando de manera especial tanto a la concentración de antocianinas como a su distribución. Además, la presencia de estos fungicidas provocó también importantes modificaciones en el perfil cromático de los vinos, con variaciones en los parámetros de saturación, luminosidad y tono. En el segundo bloque se estudió el impacto de la presencia de fungicidas en el medio fermentativo sobre el perfil proteico de la levadura S. cerevisiae Lalvin T73™. Para ello se llevaron a cabo diferentes ensayos a escala laboratorio en presencia de mepanipirim y tetraconazol a diferentes niveles de concentración. Tras la extracción y purificación del material proteico, se comparó el perfil proteico de las levaduras crecidas en presencia y ausencia de fungicidas lo que permitió determinar los cambios metabólicos sufridos a nivel celular. De este modo, ensayos llevados a cabo con un mosto comercial (complejo en nutrientes) pusieron de manifiesto que en presencia de ambos fungicidas y sus respectivas formulaciones comerciales (Frupica® y Domark® Evo) se alteró el metabolismo de compuestos organonitrogenados y, especialmente, las rutas de biosíntesis de aminoácidos y nucleótidos. En los ensayos con mosto sintético (empleando fenilalanina como única fuente nitrogenada) se observaron diferencias en función del tipo de fungicida empleado, de modo que el producto comercial a base de mepanipirim (Frupica®) ocasionó algunos cambios a nivel proteico a las 10 horas de fermentación, mientras que en presencia del producto comercial a base de tetraconazol (Domark® Evo) los mayores cambios se observaron a partir de las 36 horas. De hecho, en presencia de este último, varias enzimas involucradas en la síntesis del ergosterol incrementaron su expresión respeto a las levaduras control, poniendo de manifiesto que este fungicidas puede alterar la membrana plasmática de las levaduras vínicas y no solo las de los hongos diana. Además, en su presencia, se observó la inhibición de varias proteínas implicadas en el progreso del ciclo celular a las 48 horas de fermentación, lo que se tradujo en una reducción del crecimiento celular y un ligero descenso del consumo de azúcares.