Influence of mitochondrial genetic background on exercise performance in healthy and physical unfit populations

Resumo

A lo largo de la historia se ha prestado gran importancia al ejercicio físico tanto en el desempeño de las actividades cotidianas como en el deporte. En este campo se han realizado numerosos estudios, gracias a los cuales puede afirmarse que el rendimiento o la predisposición para el ejercicio físico depende de múltiples factores tanto genéticos (Williams and Folland 2008) como epigenéticos (entrenamiento, nutrición y mejoras tecnológicas). De hecho, muchos genes nucleares se han relacionado ya con el entrenamiento y el rendimiento en el ejercicio físico (Bray et al. 2009): la enzima conversora de angiotensina (ACE), el receptor adrenérgico 2¿ y el gen de la Na+-K+-ATPasa 2, son algunos ejemplos destacables. Para determinar la capacidad aeróbica de un individuo y, por tanto, su potencia para la realización de ejercicio físico, el parámetro de medida más extendido es el consumo de oxígeno máximo (VO2max). Durante la realización de cualquier tipo de ejercicio físico el requerimiento energético de las células aumenta, por lo que el consumo de oxígeno también aumenta, ya que este oxígeno es reducido para producir ATP, la molécula energética de la célula. Este proceso aeróbico se lleva a cabo en la mitocondria, donde la cadena de transporte electrónico proporciona los electrones necesarios para la reducción de oxígeno y la producción de ATP por parte de la ATPasa, proceso conocido como fosforilación oxidativa. Por tanto, es lógico pensar, que el parámetro que determina la capacidad aeróbica de un individuo esté influenciado por la mitocondria. De hecho se ha sugerido que la herencia del VO2max puede estar caracterizada por un efecto materno (Lesage et al. 1985) y el genoma mitocondrial es el único que presenta herencia materna y no mendeliana como ocurre en el caso de los genes nucleares. Sin embargo, estudios realizados anteriormente para encontrar una asociación entre la variabilidad genética mitocondrial (haplogrupos) y VO2max no han sido concluyentes (Dionne et al. 1991; Rivera et al. 1998; Murakami et al. 2002). Por eso uno de los objetivos principales de esta tesis era abordar este problema e intentar esclarecer la posible asociación entre el VO2max y la variabilidad genética mitocondrial. Con este motivo se reclutó una población sana masculina físicamente activa y con buenos hábitos de vida (no fumadores, no bebedores habituales de alcohol y no consumidores de drogas), a la que se le determinó: el VO2max mediante una prueba de esfuerzo y los haplogrupos mitocondriales, usando la estrategia basada en la secuenciación de la región HV-I del genoma mitocondrial y su posterior confirmación con PCR/RFLPs de la región codificante (Torroni et al. 1992; Torroni et al. 1994; Torroni et al. 1996; Richards et al. 2000). Con los resultados obtenidos, se observa que el VO2max es menor en el haplogrupo J respecto a las variantes noJ (Marcuello et al. 2009), siendo el haplogrupo H, dentro de los haplogrupos noJ, el causante de esta diferencia. Además, considerando que el consumo de oxígeno depende de la frecuencia cardiaca (HR) se determinó la HRmax. Al descartarse este parámetro como responsable de esta diferencia, se concluyó que la variabilidad genética mitocondrial, entre otros posibles factores, influye significativamente sobre el VO2max. Una vez establecida esta asociación analizamos si se mantenía en atletas de élite que realizan distinto tipo de deporte, para lo que se seleccionaron dos poblaciones: atletas aeróbicos (ciclistas) y anaeróbicos (corredores de 400m). Además de observar, que el VO2max aumenta con el ejercicio regular, independientemente del tipo que sea, y que el ejercicio aeróbico induce un mayor incremento de este parámetro que el anaeróbico, los resultados establecieron que esta influencia genética desaparece con cualquier tipo de entrenamiento regular, lo que sugiere potenciales aplicaciones en la práctica del ejercicio físico y también en la salud. Siguiendo por esta vía, estudiamos las modificaciones que se producían con un entrenamiento puramente aeróbico y otro anaeróbico en una población joven. Aunque hubo problemas durante la realización del estudio y muchos objetivos planteados inicialmente no pudieron abordarse, si que se observaron algunos resultados interesantes. Entre ellos, el contenido de los diferentes tipos de cadenas pesadas de la miosina (MHC) del músculo esquelético (determinado mediante electroforesis de las proteínas del músculo esquelético en geles de acrilamida SDS-desnaturalizantes) se correlacionó significativamente con el VO2max y la dosis genómica mitocondrial. En concreto, el contenido de MHC1 correlaciona positivamente con ambos y el contenido de MHC2A y el de MHC2X lo hacen negativamente también con ambos parámetros. Este resultado es consistente con el hecho de que las MHC1 se encuentran mayoritariamente en fibras musculares aeróbicas y las MHC2A y MHC2X tienen mucha menos representación en las fibras musculares aeróbicas. Otra observación muy interesante es que la dosis genómica mitocondrial correlaciona positivamente con el VO2max, estableciendo otro apoyo a la conclusión de que el VO2max está influenciado por la mitocondria. Para ahondar más en la cuestión, el siguiente paso fue estudiar el efecto del ejercicio sobre las moléculas de DNA mitocondrial (mtDNA). En un estudio anterior, nuestro grupo había observado una caída de la dosis genómica mitocondrial tras la realización de un ejercicio fatigante prolongado (Marcuello et al. 2005). Otros estudios han asociado el ejercicio intenso y prolongado con un aumento del estrés oxidativo y la producción de ROS en el músculo esquelético (Bejma and Ji 1999; Tonkonogi et al. 2000; Di Meo and Venditti 2001; Leeuwenburgh and Heinecke 2001; Jackson 2008). La caída del mtDNA de este estudio se atribuyó, por tanto, a un aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y a una lenta recuperación del número de copias porque la biogénesis mitocondrial requiere gran cantidad de energía que no está disponible durante el ejercicio intenso. Considerando estas observaciones, otro objetivo importante de esta tesis fue estimar si existía daño oxidativo mitocondrial suficiente que justificara esta caída en la dosis genómica mitocondrial con el ejercicio intenso. Para ello, y teniendo en cuenta que las técnicas desarrolladas para tal efecto no se ajustaban a las condiciones de nuestro experimento, diseñamos una nueva técnica de PCR a tiempo-real. Este técnica se basa en el hecho conocido de que la presencia de bases dañadas en el DNA bloquean la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Ponti et al. 1991), dando lugar a una disminución de la amplificación de las hebras dañadas del DNA con respecto a las hebras no dañadas. También se ha observado que la amplificación del DNA está afectada por la presencia de nucleótidos oxidados dañados en una molécula de mtDNA y la disminución en esta amplificación está correlacionada positivamente con el tamaño del fragmento que se amplifica (Yakes and Van Houten 1997; Ayala-Torres et al. 2000) . Por tanto, la relación entre las copias estimadas de un fragmento corto (80pb) de una secuencia del mtDNA y las de un fragmento largo (162pb) en la misma región será mayor cuanto más alto sea el nivel de daño. Esta nueva técnica de PCR a tiempo-real se probó en cíbridos transmitocondriales tratados con distintas concentraciones de H2O2, comprobando así que era capaz de medir diferencias de daño sobre el mtDNA, y finalmente se validó en una población anciana reclutada en un estudio paralelo de longevidad que estábamos realizando. Muchas evidencias se han publicado demostrando que el proceso de envejecimiento está fuertemente relacionado con el daño oxidativo en el DNA (von Zglinicki et al. 2001) y la pérdida de la función mitocondrial como consecuencia de la acumulación de mutaciones somáticas en el mtDNA (Wallace 1999; Chinnery et al. 2002; Wallace et al. 2003). El efecto del daño en el mtDNA sobre el envejecimiento ha sido publicado repetidas veces (Ames et al. 1993; Shigenaga et al. 1994; Shigenaga et al. 1994; Mecocci et al. 1999) y los resultados obtenidos con nuestra nueva técnica confirman estos estudios, ya que se observa que la población anciana presenta mayor daño en el mtDNA que la población joven (20-40años) (Dominguez-Garrido et al. 2009). Una vez validada la técnica, se determinó el daño oxidativo mitocondrial en músculo esquelético antes y después de un ejercicio intenso fatigante, pero no se pudo llegar a ninguna conclusión porque la nueva técnica está limitada y no es aplicable en situaciones de alta producción de ROS. Sin embargo, se observó que los individuos con haplogrupo H presentan mayor daño oxidativo mitocondrial que los individuos J. Además, en coherencia con este resultado, se encontró una correlación positiva entre el VO2max y el daño oxidativo mitocondrial, confirmando que el consumo de oxígeno y el daño oxidativo mitocondrial son procesos íntimamente relacionados. En concreto, la mayor parte del oxígeno consumido es utilizado en la cadena de transporte electrónica mitocondrial (ETC) para producir ATP y ROS. Se ha propuesto que el balance entre la generación de ATP y la producción de calor está determinada por la eficiencia de acoplamiento entre el gradiente electroquímico y la síntesis de ATP (sistema OXPHOS) (Mishmar et al. 2003). En un sistema OXPHOS muy acoplado, como sería el caso del haplogrupo H, con exceso de electrones en ETC, éstos se tranferirían directamente a la molécula de oxígeno maximizando la producción de ROS (Wallace 2005), mientras que en un sistema OXPHOS menos acoplado (haplogrupo J) el exceso de electrones se disiparía para producir calor y se generaría menos ROS. Por tanto, esta hipótesis de que la variabilidad mitocondrial puede ser responsable de los cambios en la actividad del sistema OXPHOS supone que también lo puede ser en las diferencias observadas en el consumo de oxígeno, siendo la variabilidad mitocondrial la responsable de las diferencias hereditarias en el VO2max previamente publicadas (Lesage et al. 1985; Fox et al. 1996; Bouchard et al. 1997; Bouchard et al. 1998; Bouchard et al. 1999) y confirmada en esta tesis (Marcuello et al. 2009; Marcuello et al. 2009). Más aún, las variaciones no patológicas en el mtDNA presentan consecuencias fenotípicas en enfermedades neurodegenerativas (van der Walt et al. 2003; van der Walt et al. 2004), diferencias en la penetrancia de algunas enfermedades (Brown et al. 1997; Brown et al. 2002; DiMauro and Schon 2003), diferencias en la motilidad espermática en humanos (Ruiz-Pesini et al. 2000; Montiel-Sosa et al. 2006) y en la senescencia (De Benedictis et al. 1999; Ivanova et al. 1999; Rose et al. 2001; Ross et al. 2001; Niemi et al. 2003; Cacabelos et al. 2005; Santoro et al. 2006; Dominguez-Garrido et al. 2009). Considerando estos antecedentes y sin olvidar el ejercicio físico, nos marcamos un último objetivo, estudiar la influencia mitocondrial en una enfermedad que produce un impedimento en la realización del ejercicio físico, pero que no es producto ni de una patología mitocondrial ni de una muscular, como es el caso de la fibromialgia. Se escogió este síndrome porque además se ha observado una agregación familiar y una preponderancia en mujeres (Buskila et al. 1996; Buskila and Sarzi-Puttini 2006), indicando una posible influencia de la mitocondria. La fibromialgia es una patología crónica que causa un dolor generalizado, no articular, con afección de los músculos y con exagerada sensibilidad en los puntos gatillos, fatiga y una variedad de síntomas. La fibromialgia es concomitante con una variedad de síndromes entre los que se encuentra la fatiga crónica, caracterizada por una fatiga severa, debilitante y prolongada, neuromioastemia o encefalomielitis miálgica, que debe presentarse al menos durante seis meses reduciendo progresivamente el nivel de actividad del paciente. Las similitudes encontradas entre ambos síndromes dificultan seriamente a los médicos diferenciar su diagnóstico, ya que el 70% de los pacientes con fatiga crónica presentan características de la fibromialgia mientras que el 42% de los pacientes de fibromialgia reúnen los criterios de la fatiga crónica (Goldenberg et al. 1990; Adler 2004). Por lo tanto y considerando el solapamiento de sus características clínicas, muchas veces se estudian en conjunto (Kop et al. 2005), como es el caso de esta tesis. Para ello, y con ayuda de la Asociación Aragonesa de Fibromialgia y Fatiga Crónica (ASAFA), se reclutó una población de pacientes, diagnosticadas siguiendo los criterios del American Collage of Rheumatology (ACR), y una de controles para llevar a cabo el estudio genético. Sin embargo, a un grupo más reducido de pacientes y controles (40 persona en total) se le realizó un estudio más completo incluyendo bioquímica y hemograma (para descartar otras patologías) y una valoración de la condición física aeróbica (prueba de esfuerzo) y diferentes manifestaciones de la fuerza. Con esta valoración física se concluyó que los pacientes diagnosticados con fibromialgia presentan una disminución de su capacidad para la actividad física y menor VO2max que la población sana. Por el contrario, no se observó diferencias en la distribución de los haplogrupos mitocondriales entre la población de fibromialgia y la sana, aunque las variantes más oxidativas se encuentran sobre representadas en los pacientes. Sin embargo, esta tendencia debe ser confirmada en futuros estudios.