Utilidad de la luz polarizada en el laboratorio de reproducción asistida

Abstract

El estilo de vida actual ha modificado la estrategia reproductiva de las mujeres. Durante los últimos años, son diversos los motivos que han ido retrasando paulatinamente la edad de inicio de la maternidad, lo cual ha repercutido directa y negativamente en la capacidad reproductiva de la mujer. Además de la edad, los efectos nocivos de varias sustancias de consumo habitual como el alcohol, tabaco, cafeína y algunas drogas también afectan de manera significativa a la reproducción. Todos estos factores han contribuido al aumento de la población estéril. La Organización Mundial de la Salud define la esterilidad como “la imposibilidad de una pareja para conseguir un embarazo tras mantener relaciones sexuales regulares no protegidas durante un año”. Se estima que un 15% de las parejas con deseo gestacional tienen dificultad de concebir tras este período. Además de las parejas con problemas de esterilidad, hay numerosos grupos poblacionales que también necesitan recurrir a las técnicas de reproducción asistida para poder cumplir su deseo gestacional: personas con enfermedades genéticas que no quieren transmitir la enfermedad a su descendencia, parejas serodiscordantes, parejas del mismo sexo, mujeres sin pareja, mujeres que deseen preservar la fertilidad para postergar su maternidad por motivo médico o social, personas que han visto comprometida su fertilidad debido a un tratamiento oncológico … Todo esto hace que cada vez haya más gente que recurre a las clínicas de reproducción asistida buscando una solución a sus problemas. Es por ello qué, para poder satisfacer todo este tipo de demandas con las mejores garantías, la medicina de la reproducción está en continuo desarrollo. Es necesaria la optimización de todos y cada uno de los procesos implicados en estas técnicas para garantizar los mejores resultados. Históricamente, las tasas de implantación en los procesos de reproducción asistida eran muy bajas. Como consecuencia, las tasas de embarazo también eran bajas. Para minimizar estos malos resultados era aceptable la transferencia de varios embriones por ciclo. Con esta estrategia, además de aumentar la probabilidad de embarazo, se evitaba el tener que criopreservar los embriones de buena calidad sobrantes, ya que la criopreservación embrionaria no ofrecía buenos resultados de supervivencia. En los últimos años, los grandes avances introducidos en este campo han propiciado, entre otros, un aumento de la tasa de implantación, lo cual, unido a la transferencia de más de un embrión por ciclo, ha traído emparejado un aumento considerable de las gestaciones múltiples especialmente en nuestro país, donde los últimos datos obtenidos por la Sociedad Española de Fertilidad muestran un 26% de gestaciones de este tipo. Es sabido que, este tipo de gestaciones acarrean graves consecuencias tanto para la madre como para la futura descendencia, por lo que nuestro deber, en la medida de lo posibles, es intentar evitarlas. Así, el objetivo de las técnicas de reproducción es garantizar un recién nacido vivo sano por ciclo. Y este es, actualmente, uno de los grandes retos en el campo de la fertilidad. Para poder llevar a cabo la transferencia de un único embrión con cierta garantía de éxito, debemos contar, principalmente, con unos buenos criterios de selección embrionaria y posteriormente, con un buen programa de criopreservación que nos permita conservar los embriones sobrantes de buena calidad, manteniendo así la tasa de embarazo acumulado por ciclo de fecundación in vitro iniciado. Son numerosos los sistemas de selección embrionaria existentes, desde la clásica y subjetiva morfología hasta el novedoso time-lapse, pasando por técnicas de selección invasivas como el screening de aneuploidías embrionarias. Cada uno de estos sistemas de selección embrionaria tienen sus ventajas y sus desventajas, pero todavía falta un criterio objetivo y definitivo que nos ayude a seleccionar los mejores embriones. Es evidente la importancia de encontrar un buen marcador que nos facilite el difícil proceso de selección embrionaria. Este marcador debería de cumplir una serie de requisitos: no ser invasivo, no ser subjetivo, no suponer un coste económico elevado para los pacientes, que su valoración no tenga repercusión negativa en el desarrollo posterior del embrión, que no sea laboriosa su utilización y que pueda hacerse extensivo a todos los laboratorios. Mientras surgen nuevas tecnologías continuamente, en nuestro laboratorio creemos que una buena aproximación al marcador ideal sería la valoración del huso meiótico de los ovocitos. El huso meiótico es una estructura crucial para la correcta segregación cromosómica durante la meiosis. Las alteraciones a nivel del huso meiótico se han relacionado con la no disyunción de cromosomas, lo que resultaría en ovocitos aneuploides. Esta sería una de las principales causas de bloqueo de la división embrionaria, abortos espontáneos y defectos congénitos. La posibilidad de evaluar el huso meiótico de los ovocitos no es nueva. Desde hace varios años, mediante técnicas que requerían la tinción y fijación de los ovocitos, se podía visualizar la estructura del huso meiótico. El problema principal de estas técnicas es que eran invasivas y no permitían utilizar los ovocitos una vez evaluado el huso meiótico, quedando restringidas principalmente al ámbito de la investigación. Actualmente, con la incorporación de equipos de luz polarizada a los laboratorios, es posible visualizar el huso meiótico de los ovocitos. Los microscopios de luz polarizada iluminan al ovocito con una intensidad de luz similar a los microscopios de contraste de fases utilizados habitualmente, por lo que su uso no compromete la viabilidad de la célula ni el desarrollo embrionario posterior. El hecho de poder visualizar los ovocitos sin dañarlos y sin que afecte al resultado reproductivo posterior, hacen de la luz polarizada un equipo para tener en cuenta además de a nivel experimental, para su uso clínico. Numerosos grupos de investigación han intentado demostrar la utilidad de los equipos de luz polarizada para valorar el huso meiótico en la actividad clínica diaria. Entre otros, se ha estudiado la relación entre la presencia o ausencia de huso meiótico con las tasas de fecundación, con el ritmo de división, con calidad embrionaria y formación de blastocisto y con las tasas de embarazo e implantación. Debido al origen de los ovocitos utilizados, a la técnica de detección de los husos meióticos, a los diferentes parámetros evaluados… los resultados obtenidos hasta el momento son muy heterogéneos, lo cual dificulta conocer realmente la utilidad de estos equipos en la práctica clínica. En este trabajo hemos estudiado parte de los parámetros evaluados previamente por otros autores, para comprobar la reproducibilidad en nuestra población de ovocitos y con nuestros protocolos y, además, hemos intentado ampliar la utilidad de la luz polarizada como sistema de selección embrionaria con la finalidad de valorar la posible utilidad de la luz polarizada en la rutina diaria de una clínica de reproducción asistida. Para ellos vamos a utilizar un equipo de luz polarizada que lleva incorporado una cámara y un software que nos ayudará al procesado de imágenes (Oosight). Este equipo nos va a permitir observar algunas estructuras de los ovocitos, entre ellas el huso meiótico. El huso meiótico, al ser iluminado con luz polarizada, exhibe una propiedad óptica intrínseca llamada doble refringencia o birrefringencia. La birrefringencia, también conocida como doble refracción de la luz, es un fenómeno óptico que ocurre cuando la luz pasa a través de una estructura anisotrópica provocando que el haz de luz se divida en dos rayos que viajan a velocidades diferentes. La diferencia de velocidad entre los dos rayos de luz se llama retardancia. La unidad fundamental de la retardancia es el número de longitudes de onda que se retrasa y se mide en nanómetros. Cuanto mayor es la diferencia de fase entre el rayo rápido y el lento, mayor es la retardancia. En este caso, la birrefringencia es debida a la orientación de los microtúbulos de huso meiótico. Un valor de retardancia elevado puede ser interpretado como un grado elevado de organización macromolecular y densidad estructural, lo cual sería indicador de estructuras bien alineadas u organizadas. El Oosight nos va a permitir realizar una valoración tanto cualitativa del huso meiótico (presencia o ausencia) como cuantitativa (comparando los valores de refringencia del huso meiótico obtenidos). De hecho, la principal característica que diferencia este trabajo del resto de los trabajos publicados es que, se ha evaluado el huso meiótico de cada de uno de los ovocitos de forma individual y cuantitativa, aportando objetividad al estudio. Los ovocitos evaluados en el presente estudio proceden de mujeres que se han sometido a un ciclo de ICSI en la Unidad de Reproducción Asistida del Hospital Quironsalud de A Coruña. Es una investigación de tipo observacional y retrospectiva. Con la finalidad de obtener un número adecuado de ovocitos, a las mujeres se las sometió a una estimulación ovárica controlada mediante la administración de diferentes hormonas. Una vez alcanzado el tamaño folicular adecuado, se indujo la ovulación. 36h después, se sometió a la mujer a una punción folicular para la obtención de los ovocitos. Los ovocitos se mantuvieron en cultivo en el laboratorio hasta su uso. Para poder realizar la visualización del huso meiótico y la microinyección espermática, fue necesario liberar al ovocito del grupo de células que lo rodeaban, dicho proceso se denomina decumulación. La decumulación se realizó a las 37 – 38h posteriores a la administración del inductor de la ovulación. Una vez que los ovocitos se han decumulado, es fácil observar su estadio madurativo en el microscopio invertido. En una punción folicular podemos obtener los ovocitos en tres estadios madurativos diferentes: vesícula germinal (ovocito detenido en la profase I), metafase I (ovocito en metafase I) y metafase II (ovocito detenido en la metafase II). Los ovocitos metafase II son los que se van a utilizar en el presente estudio. La valoración del huso y posterior microinyección se realizó a partir de las 38 – 39h post administración del inductor de la ovulación. Antes de proceder con la microinyección, se analizó uno a uno los ovocitos con la luz polarizada con la finalidad de localizar el huso meiótico. Para ello se rotó cada ovocito con la micropipeta de ICSI en sucesivas ocasiones hasta que se visualizó el huso correctamente. En caso de no visualizar el huso y antes de considerar que el ovocito carece de él, debemos rotar el ovocito en todos los sentidos varias veces y con distintos enfoques. Solo después de un exhaustivo proceso de búsqueda podemos confirmar que el ovocito carece de huso. Tras la microinyección, los ovocitos permanecieron en cultivo. En los días posteriores, se evaluó la fecundación, así como el desarrollo embrionario de los ovocitos que habían fecundado correctamente. En el día 3 o 5 de desarrollo embrionario se seleccionó el embrión de mejor calidad para transferirlo al útero de la mujer. El resto de los embriones viables se vitrificaron. Las transferencias de embriones vitrificados se realizaron posteriormente en ciclo natural (en la mayoría de los casos) o sustituido (en mujeres sin función ovárica). En el presente estudio se han incluido un total de 86 ciclos de ICSI de 86 pacientes. Del total de ovocitos obtenidos (711), se han evaluado sólo los ovocitos metafase II (569). Además, también se ha evaluado el resultado reproductivo de los embriones precedentes de dichos ovocitos que se han transferido y cuyos datos de implantación son conocidos (195). Los datos del presente estudio incluyen transferencias de embriones de día 3 y día 5 y transferencias de embriones en fresco y embriones previamente vitrificados. Se ha evaluado la relación entre la presencia y ausencia del huso meiótico y fecundación (normal y aneuploide), calidad embrionaria (evaluada en función de la incidencia de divisiones anómalas durante el desarrollo embrionario y de los embriones que alcanzan el estadio de blastocisto), implantación embrionaria y resultado reproductivo (evaluado como tasas de recién nacido vivo y de aborto). Además, se ha analizado la importancia de la valoración del huso meiótico en circunstancias especiales, como la edad materna avanzada y como complemento a la selección embrionaria morfológica clásica. De la misma manera, se ha analizado la relación entre los valores de refringencia del huso meiótico y los parámetros citados previamente. Las diferentes variables analizadas son: tasa de fecundación normal, tasa de fecundación anómala, porcentaje de divisiones anómalas, porcentaje de blastocistos, tasa de implantación, tasa de recién nacido vivo por embrión transferido, tasa de aborto por embrión implantado. Todas las variables analizadas en el presente estudio se describen mediante su valor relativo (%). Para su comparación se utilizó el Test de Chi Cuadrado. En todos los casos se aplicó un nivel de significación (p-valor) del 5%. Las diferencias > 0,05 se consideraron no significativas. De los 569 ovocitos obtenidos y clasificados como metafase II tras ser decumulados, en 456 se visualizó el huso meiótico (80,5%). En 82 no se visualizó el huso meiótico (14,7%) y en 31, a pesar de haber extruido el primer cuerpo polar, aún no había finalizado la meiosis I y se encontraban en telofase I (5,5). Los ovocitos en los que se visualizó el huso meiótico presentan mayores tasas de fecundación respecto de los grupos de ovocitos sin huso meiótico y ovocitos en telofase (77,8% vs 67,1% y 58% respectivamente). En este grupo de ovocitos también apreciamos un menor porcentaje de fecundación aneuploide, sin que las diferencias observadas sean significativas. En 28 de las 86 pacientes incluidas en el presente estudio se utilizó un incubador con sistema time-lapse para realizar el cultivo embrionario (Embryoscope). De los 209 ovocitos metafase II obtenidos, fecundaron correctamente 151 que son los que se utilizaron para evaluar la calidad embrionaria. Las divisiones anómalas (definidas como patrones de división embrionario no convencionales, como pueden ser divisiones de 1 a 3 células de forma directa o en menos de 5h, división de 1 a más células, divisiones inversas…) se evaluaron en los 151 ovocitos mientras que la llegada a blastocisto sólo se pudo evaluar en los 108 embriones en los que se realizó cultivo largo. Los embriones obtenidos a partir de los ovocitos en los que se visualizó el huso meiótico poseen mayor calidad embrionaria (respecto de los embriones originados a partir de ovocitos sin huso meiótico o en telofase), evaluada en función de la incidencia de divisiones anómalas (20,3% vs 39,3%) y la cantidad de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto (46,6% vs 16,6%). De los 569 ovocitos metafase II, 428 fecundaron correctamente. De estos 428 ovocitos fecundados se transfirieron 263 embriones en un total de 158 transferencias. En el presente estudio se incluyen sólo 124 transferencias con un total de 195 embriones transferidos cuyo resultado resultó informativo (transferencias de un solo embrión independientemente de su resultado reproductivo y transferencias de dos embriones con resultado negativo o resultado positivo con la confirmación posterior de la presencia de dos sacos gestacionales con latido fetal positivo). Los embriones obtenidos a partir de ovocitos en los que se visualizó el huso meiótico presentaron mayor tasa de implantación. Dentro de los embriones en los que se visualizó el huso meiótico, se establecieron categorías en función de los valores de retardancia obtenidos. Para evitar sesgos debido al número de casos de cada grupo, las distintas categorías se establecieron basándonos en los cuartiles. De las cuatro categorías obtenidas encontramos una, la última, cuyos valores de retardancia son más elevados, en la cual la tasa de implantación es mayor. En los 55 embriones que implantaron evaluamos el resultado reproductivo. Los embriones que se originan a partir de ovocitos en los que se puede visualizar el huso meiótico presentan mayor tasa de recién nacido vivo. Esta diferencia es aún mayor en los embriones con valores mayores de retardancia. No hemos podido encontrar diferencias en la tasa de aborto. Cuando evaluamos la presencia/ausencia del huso meiótico en mujeres en función de su edad (< 38 años, > 38 años), no observamos diferencias en tasas de fecundación ni en calidad embrionaria, mientras que observamos claramente que la proporción de ovocitos con huso meiótico es mayor en mujeres de menor edad. En los grupos de edad establecidos, también evaluamos la tasa de implantación. De forma global, observamos mayor tasa de implantación en las mujeres de menor edad, pero si desglosamos las tasas en función del origen de los embriones transferidos (ovocitos con huso meiótico, ovocitos sin huso meiótico o en telofase) observamos que las tasas de implantación son similares. Posteriormente, se clasificaron de forma retrospectiva, los embriones transferidos (y seleccionados previamente mediante la clasificación morfológica de ASEBIR) en función de la presencia/retardancia y ausencia de huso meiótico. La clasificación obtenida se comparó con la clasificación morfológica utilizada en la clínica para seleccionar los embriones transferidos. Podemos observar como la clasificación obtenida con la visualización del huso meiótico se relaciona mejor con las tasas de implantación que la clasificación morfológica, para los casos analizados. Son varios los motivos por los cuales es posible que no podamos visualizar el huso meiótico de los ovocitos. Si descartamos las condiciones de cultivo adversas (cambios de temperatura y pH principalmente) y esperamos el tiempo suficiente antes de evaluar los ovocitos (ya que se ha visto que durante la maduración ovocitaria el huso meiótico es dinámico y puede desaparecer temporalmente de forma fisiológica) permitiendo que los ovocitos finalicen la maduración, podemos relacionar los ovocitos en los cuales no visualizamos el huso meiótico con ovocitos que, por diversos motivos, han sufrido alguna alteración durante su desarrollo. Esto justificaría los resultados de este trabajo, en el cual relacionamos la ausencia de huso meiótico con peor tasa de fecundación, mayor tasa de fecundación aneuploide, peor calidad embrionaria y peor tasa de implantación. A la vista de los resultados presentados, podemos considerar la presencia de huso meiótico como un marcador de buen pronóstico reproductivo, en términos de fecundación, calidad embrionaria y tasa de implantación. Así mismo, podemos considerar la retardancia del huso meiótico como un buen marcador tanto de implantación embrionaria como de recién nacido vivo. Además, la posibilidad de evaluar la presencia y retardancia de huso meiótico, nos permite seleccionar ovocitos de buen pronóstico reproductivo independientemente de la edad de la mujer, así como optimizar de forma objetiva la tradicional clasificación morfológica. Los resultados obtenidos en el presente trabajo avalan la utilidad clínica de la luz polarizada. La detección y cuantificación del huso meiótico de los ovocitos es de gran utilidad para la selección ovocitaria y embrionaria. Así mismo, la detección y cuantificación del huso meiótico de los ovocitos nos permite establecer diagnósticos y tomar decisiones de una manera única en la práctica clínica.