Implementation of new strategies for mutational and functional characterization of families with clinically suspected Bardet-Biedl syndrome

Resumo

El síndrome de Bardet-Biedl (SBB) es una enfermedad genética rara perteneciente al grupo de las ciliopatías, un conjunto de patologías caracterizadas principalmente por defectos en la estructura y/o función de los cilios primarios. Estos orgánulos altamente conservados se proyectan desde la superficie de la mayoría de las células eucarióticas y funcionan como una antena receptora de señales del entorno celular, jugando un papel importante en la regulación de múltiples vías de señalización. El SBB presenta una afectación multisistémica, por lo que los pacientes afectos suelen presentar un cuadro clínico muy amplio y diverso. Así, estos pacientes desarrollan distrofia de retina, obesidad, polidactilia, anomalías urogenitales y renales, y deterioro cognitivo como principales características clínicas, comúnmente acompañadas de diversos rasgos secundarios, dejando patente la gran heterogeneidad clínica asociada a este síndrome, que, junto con el frecuente solapamiento con otras ciliopatías, complica mucho su diagnóstico. Este síndrome se caracteriza a su vez por una gran heterogeneidad genética, con 21 genes identificados hasta la fecha que explicarían aproximadamente el 80% de los pacientes con diagnóstico clínico de SBB, lo que sugiere que nuevas mutaciones en genes conocidos así como nuevos genes causales permanecen sin ser identificados. Normalmente presenta un modo de herencia autosómica recesiva, pero en los últimos años varios autores han propuesto modelos de herencia más compleja (oligogénica) para poder explicar la frecuente variabilidad clínica inter- e intrafamiliar. La mayoría de las proteínas BBS se localizan en los cuerpos basales y centrosomas, y son necesarias para el correcto desarrollo, mantenimiento y función del cilio primario. Ocho de estas proteínas constituyen un complejo multiproteico conocido como BBSoma, el cual participa en el tráfico vesicular de proteínas de membrana hacia el cilio primario y bidireccionalmente dentro del axonema ciliar, promoviendo el proceso de ciliogénesis. El ensamblaje del BBSome está principalmente mediado por el complejo que forman otras tres proteínas BBS junto con la familia de chaperoninas CCT/TRiC, proceso en el que también intervienen otras proteínas BBS, así como en su localización y transporte. Además de estas funciones, las proteínas BBS participan, en diferente medida, en la correcta regulación de la longitud ciliar, y tanto la presencia de proteínas defectivas como la ausencia de las mismas conducen a alteraciones en numerosas vías de señalización necesarias para la correcta formación y función de muchos órganos y tejidos involucrados en la patogénesis del SBB. Aunque numerosos estudios han contribuido a definir el papel de los diferentes genes BBS y diseñar diversas estrategias para el diagnóstico molecular del SBB, así como profundizar en las funciones que desempeñan dichas proteínas, estos avances no han sido suficientes para desarrollar un tratamiento completo para este síndrome y poder ofrecer a los pacientes alguna opción terapéutica, inexistente hasta la fecha. Cabe destacar la ventaja que ha supuesto la aplicación de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva, principalmente la secuenciación de exoma completo, tanto en investigación como en la práctica clínica, pues han permitido identificar nuevas variantes así como nuevos genes candidatos a un ritmo cada vez mayor, facilitando la obtención de un diagnóstico molecular más rápido y preciso. Por todo ello, sigue siendo necesario abordar con mayor profundidad diversos aspectos como la carga mutacional, la optimización de estrategias diagnósticas en el SBB, la caracterización funcional de variantes potencialmente patogénicas y la posible implicación de nuevos genes en la biología ciliar, los cuales han sido abordados en este proyecto de tesis doctoral y serán explicados a continuación con mayor detalle. En primer lugar, se analizó la contribución del gen BBS1 en una cohorte mayoritariamente española de 49 pacientes (45 familias) con sospecha clínica de SBB y para los que un cribado previo con un microchip de genotipado (Asper Biotech), que incluye las mutaciones predominantes en los genes BBS y ALMS1, proporcionó un resultado negativo, es decir, tan sólo uno o ningún alelo mutado. Se eligió este gen dado que se trata del gen más frecuentemente mutado en los estudios poblacionales publicados hasta el momento en diversas cohortes mundiales de afectos de SBB. Así, tras analizar este gen mediante secuenciación directa en los pacientes seleccionados, se identificaron tres variantes patogénicas en cinco pacientes pertenecientes a tres familias independientes, suponiendo un 6.7% del total. El hecho de que el microchip de genotipado previamente utilizado incluye la variante patogénica p.Met390Arg, la más frecuente en el SBB, podría explicar la baja contribución del BBS1 en los pacientes estudiados. Teniendo en cuenta las 96 familias que constituyen nuestra cohorte total y los datos previos del grupo, el gen BBS1 contribuye en un 22% a la carga mutacional total, convirtiéndose en el gen más frecuentemente mutado en nuestra cohorte, seguido de BBS12 y BBS10. Este valor coincide con la mayoría de estudios previos, que lo sitúan entre un 17% y un 25%. Por otro lado, del total de las 21 familias de la cohorte completa con variantes en BBS1, 15 de ellas resultaron ser homocigotas para la variante p.Met390Arg, y, de las seis familias restantes, cuatro de ellas fueron portadoras de dicha variante en heterocigosis, lo que esta variante supone un 81% de los alelos BBS1 totales. Estos datos reflejan el importante papel juega esta variante tanto en los pacientes con variantes en BBS1 como en población SBB general. Por tanto, teniendo en cuenta los resultados anteriores, proponemos la secuenciación directa del gen BBS1 completo, así como la de los genes BBS10 y BBS12, como segundo paso en nuestro algoritmo diagnóstico diseñado para cohorte española de SBB, tras descartar previamente la presencia de las variantes predominantes en este síndrome (p.Met390Arg en BBS1 y p.Cys91Leufs*5 en BBS10). Además de destacar la importancia de la variante más predominante, este estudio ha permitido ampliar el espectro mutacional de esta patología gracias a la identificación de dos nuevas variantes potencialmente patogénicas (que han sido incluidas en el European Nucleotide Archive), a su vez privadas. En cuanto a la caracterización de las variantes identificadas, además de evaluar su patogenicidad mediante diversos programas bioinformáticos, también hemos llevado a cabo un análisis in silico del posible impacto en el mecanismo de splicing, obteniéndose una predicción positiva para los tres cambios identificados en BBS1 en nuestra selección de pacientes, proporcionando más evidencias de la probable patogenicidad de las mismas. Asimismo, hemos recopilado la información clínica disponible para tratar de establecer por primera vez en población SBB española una correlación genotipo-fenotipo para los pacientes con dos alelos mutados en BBS1. Para ello, se seleccionaron un total de 33 pacientes de 20 familias distintas con diagnóstico molecular de SBB confirmado. A pesar de que el pequeño tamaño muestral y la falta de información para algunas categorías nos impidieron realizar un análisis estadístico fiable, hemos podido observar algunas tendencias que merece la pena destacar. Así, los pacientes con variantes causales en BBS1 desarrollan un espectro clínico más leve que aquellos con cambios en otros genes como BBS6, BBS10 y BBS12, ya que tan solo un pequeño número de pacientes mostraron anomalías urogenitales y/o renales, dos de las características primarias consideradas más graves. Sin embargo, el fenotipo ocular de estos pacientes parece no ser tan leve como se ha descrito en la literatura, e incluso más severo que el desarrollado por pacientes con cambios en otros genes BBS. Este hecho se observa, principalmente, entre los pacientes homocigotos para la variante p.Met390Arg, pues presentan defectos oculares como discromatopsia y cataratas (ambas con un 50%), atrofia macular y severas alteraciones de fondo de ojo, con mayor frecuencia que los pacientes heterocigotos para dicha variante causal. Estos datos clínicos también han reflejado el gran solapamiento que existe entre ciliopatías, principalmente entre el SBB y el síndrome de Alström (ALMS). Además, hemos evaluado la posibilidad de herencia oligogénica en dos familias con dos hermanos afectos cada una, siendo uno de ellos portador de un tercer alelo mutado. Tras analizar el fenotipo de los mismos, hemos comprobado que los afectos con tres alelos mutados presentan un fenotipo más severo que sus correspondientes hermanos, también afectos y con sólo dos alelos mutados, sugiriendo que el tercer alelo mutado podría tener un papel modulador del fenotipo. Todos estos hallazgos son importantes tanto para orientar el diagnóstico molecular del SBB como para el consejo genético y el manejo de estos pacientes. A continuación, se seleccionaron cuatro pacientes de familias consanguíneas independientes, en los que previamente se descartó la presencia de variantes patogénicas en los genes predominantes en nuestra cohorte (BBS1, BBS10 y BBS12), para su estudio mediante un microchip de homocigosidad, que permite identificar regiones de pérdida de heterocigosidad en las que podrían encontrarse los genes responsables de la patología en estos casos. En uno de estos cuatro pacientes fue posible identificar una variante causal en homocigosis en el gen BBS6, en el que también se había identificado, mediante el microchip de genotipado, una variante en el gen BBS5 clasificada como patogénica. Paralelamente, y de forma aislada, se analizó una familia mediante secuenciación de exoma completo, permitiéndonos identificar dos variantes causales nuevas en el gen BBS5. Tras analizar exhaustivamente las variantes identificadas mediante las diferentes técnicas genéticas (secuenciación directa, microchip de homocigosidad y secuenciación de exoma), se seleccionaron las tres variantes en BBS1 reportadas en este estudio así como las identificadas en BBS5 y BBS6, un total de siete variantes todas ellas clasificadas como potencialmente patogénicas, para su evaluar su impacto a nivel funcional en el modelo animal de pez cebra. Las variantes seleccionadas fueron: c.68G>A/p.(Trp23*), c.1097T>A/p.(Val366Asp) y c.1510_1520delCACCTGCAGAA/p.(His504Hisfs*48) en BBS1, c./p.(Arg138Cys), c.538delT/p.(Phe180Phefs*6) y c.551A>G/p.(Asn184Ser) en BBS5, y c.1232G>C/p.(Gly411Ala) en BBS6. Dadas las numerosas ventajas que ofrece, el pez cebra se ha convertido en uno de los organismos más utilizados en los últimos años para el estudio de las ciliopatías. Para ello, en primer lugar se inyectaron los morfolinos (MOs) específicos para bloquear la expresión endógena de los genes de interés y se observaron los fenotipos desarrollados en el estadio de 8-12 somitas. A continuación, se llevaron a cabo los experimentos de rescate mediante la co-inyección de los MOs con los correspondientes ARN mensajeros (ARNm) conteniendo las variantes objeto de estudio, así como los ARNm salvajes. Para evaluar con detalle los defectos en el desarrollo temprano de los embriones inyectados, estos fueron analizados mediante hibridación in situ (en inglés whole mount in situ hybridization) con un cocktail de tres sondas (myoD, krox20 y pax2). Tal y como han reportado anteriores estudios, la supresión de los genes BBS condujo a diversos defectos en la gastrulación, tales como acortamiento de la longitud del cuerpo, notocorda retorcida y más ancha, y somitas más estrechos. Los experimentos de rescate permitieron comprobar, por un lado, que los ARNm salvajes rescataron de forma eficiente dichos fenotipos, siendo estos similares a los controles (embriones no inyectados), y, por otro lado, que ninguna de las variantes inyectadas pudo rescatar el fenotipo asociado a la inyección de los MOs. De esta forma, observamos evidencias claras de la patogenicidad (en diferente grado) de las siete variantes estudiadas, produciendo defectos como pérdida parcial o total de la definición de los somitas, cabeza más pequeña y menor marcaje en los ojos, además de los anteriormente descritos. Según los resultados de esta técnica, las variantes causales en BBS1 y BBS6 parecen producir, en general, los fenotipos más severos. Como comprobación adicional, se examinó in vivo la morfología desarrollada a las 48 horas post-fertilización, observando alteraciones como cuerpo curvado, cola retorcida, otolitos supernumerarios, edema pericárdico leve e incluso hidrocefalia moderada, confirmando así los fenotipos observados mediante hibridación in situ y, por tanto, el carácter patogénico de estas variantes. Para profundizar aún más en los efectos que producen las variantes seleccionadas, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia (whole mount immunolfuorescence assays) en los embriones fijados en estadio 8-12 somitas, utilizando anticuerpos específicos para marcar los cilios de la vesícula de Kupffer (órgano ciliado transitorio). De esta forma, se ha identificado una distribución aberrante de los cilios en esta vesícula, en diferente medida en función de la variante, además de cilios más cortos (excepto para una variante en BBS5) con respecto a los cilios de los embriones control. Todos estos análisis nos han permitido corroborar la patogenicidad asociada a estas siete variantes identificadas en pacientes con SBB, y, por otro lado, reafirmar la utilidad de este organismo modelo para el estudio de las ciliopatías. Posteriormente, se seleccionó un grupo de 6 pacientes no relacionados pertenecientes a familias consanguíneas sin diagnóstico molecular confirmado (sin presencia de variantes causales en genes BBS predominantes), para su estudio mediante técnicas de secuenciación masiva, concretamente mediante secuenciación de exoma completo. Así, y tras aplicar una estrategia de filtrado de datos propia considerando en primer lugar sólo aquellos cambios homocigotos (dada la consanguinidad de las familias) y utilizando diversas herramientas bioinformáticas, hemos podido identificar variantes potencialmente patogénicas en genes ciliares conocidos en tres de estos pacientes, confirmando su diagnóstico molecular de ciliopatía: c.565C>T/p.(Arg189*) y c.1932T>A/p.(Tyr644*) en BBS2, y c.8005C>T/p.(Arg2669*) en ALMS1. Además, en otro de los pacientes se ha identificado una variante causal en el gen CRB1, previamente relacionado con el desarrollo de retinitis pigmentosa y amaurosis congénita de Leber. Este paciente presentó, en la primera evaluación clínica, distrofia de retina y obesidad, pero tras una reevaluación del fenotipo por parte de los clínicos, se comprobó que tan sólo mostraba distrofia de retina, la cual podría ser explicada por la presencia de la variante causal detectada en homocigosis en CRB1. Curiosamente, el fenotipo de la hermana afecta de este paciente, la cual fue reevaluada con posterioridad, evolucionó de tan sólo polidactilia a un cuadro clínico más complejo. El análisis de segregación reveló la presencia de dicha variante en heterocigosis, la cual no sería suficiente para explicar este fenotipo más complejo y nos hace pensar en un posible modo de herencia oligogénica, en el que sería necesaria la presencia de un gen adicional con dos alelos mutados. Estos casos reflejan la gran complejidad tanto fenotípica como genética de las ciliopatías, conduciendo en muchos casos a diagnósticos erróneos, y destacan además la importancia de una evaluación clínica completa y, principalmente, de un seguimiento continuado de estos pacientes para poder ofrecerles un diagnóstico molecular más preciso, consejo genético y un pronóstico precoz. En los dos pacientes restantes hemos identificado cuatro genes como posibles candidatos, CORO2B, SLC3A1, LMO7 y ZNF17, cuyas variantes han sido caracterizadas in silico como patogénicas. Tras indagar en las funciones de las proteínas codificadas por estos genes y teniendo en cuenta el fenotipo desarrollado, todo parece indicar que CORO2B podría ser el principal gen causal en uno de estos pacientes, descartando por tanto la implicación del gen SLC3A1, previamente relacionado con cistinuria. En cambio, en el último paciente no hemos podido decantarnos por un gen candidato entre LMO7 o ZNF17, ya que las bases de datos consultadas, los programas bioinformáticos utilizados y la información disponible en la literatura, proporcionan evidencias que apoyarían la posible causalidad de ambos genes. En este sentido, serán necesarios posteriores estudios funcionales que deberán confirmar o aclarar el papel de dichos genes en el desarrollo de patología ciliar. Finalmente, el uso combinado de la secuenciación de exoma completo y un microchip de homocigosidad nos ha permitido identificar un nuevo gen candidato, DOCK6 (previamente asociado al síndrome de Adams-Oliver, AOS), en otra familia consanguínea con sospecha clínica de SBB aunque con fenotipo dudoso. Dadas las evidencias de su papel en la organización del citoesqueleto de actina, así como la reciente vinculación del citoesqueleto con el proceso de ciliogénesis, se ha abordado la posible implicación de este nuevo gen en la correcta formación del cilio primario. Para evaluar esta hipótesis, se estableció un modelo knockdown para este gen mediante silenciamiento transitorio del mismo mediado por la transfección de células hTERT RPE-1 con un ARN de interferencia específico, alcanzando más de un 90% de reducción de la expresión a nivel de ARNm (determinado mediante qPCR). Una vez validado dicho modelo, se analizó el posible impacto del silenciamiento de DOCK6 en el proceso de ciliogénesis y la morfología ciliar mediante ensayos de inmunofluorescencia a partir de células fijadas. Los experimentos de inmunofluorescencia llevados a cabo en las células silenciadas permitieron comprobar que la capacidad de formar cilios no se veía alterada, observando de hecho una mayor proporción de células ciliadas en el grupo de células silenciadas con respecto a las células control (89.4% frente al 75.4%, respectivamente). Además, tras medir al menos 50 cilios por cada condición (control y silenciadas) y a partir de tres réplicas biológicas independientes, se observó que las células silenciadas desarrollaron cilios más largos que las células control (promedio±DE = 3.27±0.12 µm en comparación a 2.55±0.26 µm en el grupo control), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (valor p<0.05). Sorprendentemente, el análisis de la longitud ciliar permitió detectar la presencia de estructuras anómalas de los cilios primarios, tales como axonemas segmentados, curvados o retorcidos, o incluso con la punta bulbosa. Así, estos fenotipos fueron mucho más frecuentes entre las células silenciadas que en las células control (63.8+7.2% frente al 11.5+0.8% en el grupo control), lo que sugiere que el tráfico ciliar y el mantenimiento del cilio podrían estar alterados. Además, se sabe que las alteraciones en la longitud ciliar tienen importantes consecuencias en el control del ciclo celular. Por todo ello, la conservación de una longitud ciliar adecuada resulta fundamental para una correcta regulación y funcionamiento de las vías de señalización coordinadas por el cilio primario. La supresión de la expresión de DOCK6 también reveló defectos en la organización del citoesqueleto de actina, observados tras realizar ensayos de inmunofluorescencia utilizando faloidina para teñir las fibras de actina F. De esta forma, las células silenciadas exhibieron una mayor incidencia de agregados de actina F y mayor número de fibras de estrés, principalmente en la región apical de las células. Asimismo, una proporción considerable de células silenciadas adoptaron un fenotipo redondeado o inusualmente alargado, frecuentemente acompañado de una falta de lamelipodios. Estas alteraciones en la forma de las células y en el citoesqueleto de actina podrían conducir a una reducida capacidad de migración de dichas células pero, sobre todo, la alteración en la organización del citoesqueleto podría ser indicativa de una ciliogénesis defectiva. Este es el primer estudio que muestra la relación entre el gen DOCK6 y el cilio primario. Teniendo en cuenta el fenotipo desarrollado por el paciente y los resultados obtenidos, existen dos posibles interpretaciones. Por un lado, podría tratarse de nuevo caso de AOS con un espectro clínico más complejo que los reportados en este síndrome hasta la fecha, en cuyo caso este sería el primer trabajo que propone el AOS como una nueva ciliopatía. Otra posibilidad es que se trate de un paciente con una ciliopatía conocida, como SBB o ALMS, y con una descripción fenotípica nueva; en ese caso DOCK6 sería un nuevo gen asociado a ciliopatía, pudiendo ser identificado como BBS22 o ALMS2. Estudios adicionales serán necesarios para explorar en mayor profundidad estos hallazgos y aclarar el papel de DOCK6 en la regulación del ensamblaje del cilio primario y, por tanto, en el desarrollo de patología ciliar.