Bases moleculares de la hipertensión arterial pulmonarcaracterización molecular y funcional

Abstract

La Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) es una enfermedad rara, progresiva, con reducida incidencia y prevalencia en población española, pero de mal pronóstico en términos de calidad de vida y morbimortalidad. Su etiología es muy diversa produciendo una gran variabilidad tanto a nivel clínico como genético, dificultando el manejo de estos pacientes, así como la realización de un estudio diagnóstico sistemático. Esta patología está caracterizada por un incremento sostenido de la presión arterial pulmonar media ≥ 25 mmHg en reposo y ≥ 30 mmHg en ejercicio. Los principales síntomas de la HAP incluyen síncope, disnea y dolor torácido, conduciendo finalmente a la muerte prematura debido a la insuficiencia cardiaca del lado derecho. Además, en pacientes con HAP se observa un aumento de la resistencia vascular pulmonar, principalmente debido a la formación de trombos y a cambios estructurales y funcionales en la pared vascular. Indivíduos de cualquier edad pueden verse afectados por esta rara patología, aunque la mayoría de los casos adultos desarrollan la enfermedad entre los 36-50 años. La HAP se clasifica como hereditaria, enfermedad autosómica dominante con penetrancia incompleta, idiopática o primaria, de origen desconocido, o secundaria, asociada con exposición a drogas u otras enfermedades, como enfermedades del tejido conectivo, enfermedades congénitas del corazón, hipertensión portal o virus de la inmunodeficiencia humana. La enfermedad es más frecuente en mujeres, con un ratio de 1´7:1 mujeres con respecto a los hombres y la incidencia media mundial es de 1 caso por cada 100.000-1.000.000 habitantes. En cuanto a la base genética de la HAP, el gen receptor tipo II de la proteína ósea morfogenética (BMPR2), localizado en el cromosoma 2q33, es el el principal gen implicado. Se han identificado mutaciones en este gen en más del 80% de los pacientes con HAP hereditaria y en hasta el 40% de los pacientes con HAP idiopática. Otros genes también se han asociado con la enfermedad, incluyendo el receptor tipo II de la activina kinasa tipo I (ALK1/ACVRL1), localizado en el cromosoma 12q1317, la endoglina (ENG), localizado en el cromosoma 9q33-34, o los canales de potasio dependientes de voltaje, miembro 5 (KCNA5), localizado en el cromosoma 12p13. Recientemente, han sido relacionados nuevos genes con la patología como el canal de potasio, subfamilia K, miembro 3 (KCNK3), caveolina-1 (CAV1), precursor cerebellin-2 (CBLN2) o T-Box (TBX), entre otros. Asimismo, existen una serie de moduladores genéticos, que juegan un papel vital en el desarrollo de la enfermedad, en combinación con otras mutaciones. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue desenmarañar las bases genéticas y moleculares de la HAP, analizando, en una cohorte española, los genes BMPR2, ACVRL1, ENG y KCNA5 y los moduladores genéticos SERT, EDN1, AGTR1, NOS2 y TRPC6 y establecer una correlación genotipo-fenotipo entre las variantes identificadas y las características clínicas de los pacientes analizados, además de analizar funcionalmente la región promotora y las variaciones identificados en el gen BMPR2. En este estudio se incluyeron un total de 55 pacientes afectos de HAP (28 pacientes con HAP idiopática y 27 con HAP asociada), recogidos en los servicios de neumología de diferentes hospitales y a través de una colaboración con la Asociación Española de Hipertensión Pulmonar, y entre 50-100 individuos control de población española sin patología respiratoria aparente. En todos los casos, para el diagnóstico, se siguió el protocolo de manejo habitual acorde a las recomendaciones de la Sociedad Respiratoria Europea/Sociedad Europea de Cardiología y se recogieron datos clínicos, estudios de laboratorio y características hemodinámicas. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes de acuerdo con los principios éticos para la investigación médica en seres humanos establecidos en la declaración de Helsinki, acorde al protocolo del Comité Autonómico de Ética da Investigación de Galicia (CAEI-Galicia). Tras el diagnóstico 7 pacientes fueron clasificados en clase funcional I, 19 pacientes en CF II, 25 en CF III y 4 en CF IV. De los 55 pacientes incluidos en el análisis, 20 eran hombres y 35 mujeres, con una edad de diagnóstico media de 49 años. Para analizar los genes BMPR2, ACVRL1, ENG y KCNA5 y los moduladores genéticos SERT, EDN1, AGTR1, NOS2 y TRPC6 se utilizó ADN genómico extraído de sangre periférica. Este ADN fue amplificado mediante PCR con unos primers específicos. Los productos de PCR fueron separados en una electroforesis en gel de agarosa, purificado y secuenciado mediante secuenciación directa. Se analizaron in silico, con diferentes herramientas bioinformáticas, los cambios detectados para poder conocer su carácter patogénico. De todos los cambios identificados en el gen BMPR2, se analizaron funcionalmente las variaciones identificadas en la región 5´UTR mediante ensayos luciferasa, las mutaciones missense, nonsense y sinónimas mediante minigenes híbridos y las mutaciones missense y nonsense con estudios de localización subcelular. Para las construcciones de las diferentes técnicas empleadas para analizar in vitro las variaciones seleccionadas se utilizaron los vectores pGL3-Basic, pGL3-Promoter y pGL3-CMV para los ensayos luciferasa, el vector pSPL3 para los minigenes híbridos y el vectores pEGFP-N1 para la localización subcelular, donde se clonarion las región de interés. Mediante mutagénesis dirigida se obtuvieron todos los clones. Las transfecciones de las construcciones fueron realizadas en células COS-1, COS-7 y HeLa, por su sencilla manipulación y facilidad para trabajar con ellas. De este modo, se analizó funcionalmente la actividad transcripcional de la región 5´UTR del gen BMPR2 con un sistema de dobles reporteros, cambios en el procesamiento del ARNm producido por variaciones en el gen BMPR2 y alteraciones en la localización subcelular de la proteína BMPR2. Finalmente, se buscaron sitios CpG metilados en una isla CpG de la región promotora del gen BMPR2. Para ello, el ADN genómico fue modificado con bisulfito de sodio y la metilación se analizó utilizando PCR específica de metilación. Como control positivo de metilación se utilizó ADN tratado con CpG Metiltransferasa y como control negativo de metilación se utilizó ADN sin tratar. Tras el análisis mutacional se han identificado variaciones en el 98% de los pacientes. Sin embargo, tras un exahustivo análisis in silico, solo el 70% de los pacientes presentan mutaciones patogénicas en los genes BMPR2, ACVRL1, ENG y KCNA5, habiendo sido descritas, muchas de ellas, por primera vez en este estudio. Ninguna de las mutaciones clasificadas como patogénicas tras el análisis in silico han sido identificas en población control. El gen BMPR2 es el principal gen relacionado con la HAP ya que está involucrado en el 46% de los pacientes incluidos en este estudio. Sin embargo, los genes ACVRL1, ENG y KCNA5 tienen una implicación mucho menor, siendo del 18%, 29% y 11% respectivamente. Tras la correlación genotipo-fenotipo con los pacientes portadores de, al menos, una mutación patogénica, frente a los pacientes sin mutación patogénica, se han obtenido diferencias estadísticamente significativas para una menor edad de diagnóstico (p=0´003), una menor PaPm (p=0´043), una mayor RVP (p=0´043), un menor IC (p=0´040) y un menor TM6M (p=0´020). Asimismo, tras la caracterización molecular de los principales genes, se han identificado el 27% de los pacientes portadores de varias mutaciones patogénicas. Se han analizado las características clínicas y hemodinámicas entre este grupo de pacientes con más de una mutación patogénica frente a pacientes sin mutación, obteniendo diferencias estadísticamente significativas para RVP (p=0´030) y para el IC (p=0´042). El valor para la RVP presenta un valor significativamente más alto que en los demás pacientes y el IC presenta un valor significativamente más bajo. Tras el análisis funcional de la región 5´UTR del gen BMPR2 se ha observado que las mutaciones c.1-347C>T, c.1-301G>A y c.1-92C>A producen una disminución de la actividad transcripcional con un rango entre 70-77% y que la mutación c.1-279C>A produce una disminución del 93% al compararlas con la contrucción salvaje (p<0´001). Sin embargo, la mutación c.1-186A>G tan solo produce una disminución de la actividad transcripconal de 2% (p=0´495). Además, tras un análisis in silico se demostró que estas mutaciones podrían afectar a la unión de determinados factores de transcripción y a la estructura secundaria del ARNm de la región 5´UTR del gen. Tras el análisis bioinformático se han identificado mutaciones que presuntamente podrían afectar al mecanismo del splicing y se han analizado mediante minigenes hibridos 23 variaciones. Este estudio ha clasificado 9 de las variaciones como mutaciones de splicing, 3 sinónimas (p.R211R, p.V278V y p.P327P), 3 missense (p.C84F, p.P138A y p.K467R) y 3 nonsense (p.S52Sfs*2, p.Y218* y p.W298*). Las mutaciones p.C84F, p.V278V y p.P327P producen la eliminación completa del exón donde fueron localizadas, produciendo una proteína aberrante y, en dos de los casos, produciendo un cambio en la pauta de lectura. Las mutaciones de splicing p.R211R, p.P138A y p.K467R producen una pequeña eliminación del gen, originando sitios 5´ o 3´ alternativos, produciendo proteínas aberrantes más pequeñas. Finalmente, tal y como cabría esperar, las mutaciones nonsense p.S52Sfs*2, p.Y218* y p.W298* producen un codón de parada prematuro. Finalmente, las demás variaciones analizadas no han mostrado un patrón de splicing alterado, no produciendo cambios a nivel proteico. Sin embargo, no podemos descartar que las mutaciones negativas para el splicing no produzcan algún tipo de disminución de la expresión génica o alguna interacción defectuosa con otras proteínas relacionadas. Los ensayos de inmunofluorescencia nos han permitido comprobar la localización subcelular de la proteína BMPR2. La proteína salvaje mostró una expresión en la membrana plasmática y en la región perinuclear. Sin embargo, las mutaciones p.S52Sfs*2 y p.C84F producen un patrón de expresión citoplasmático difuso y no muestran expresión en la membrana plasmática y las mutaciones p.Y218* y p.W298* producen un patrón vesicular en la membrana plasmática la primera y a nivel citoplasmático la segunda. Las demás mutaciones nonsense no presentan alteraciones en la localización subcelular de la proteína. En la región promotora del gen BMPR2 se identificó una gran isla CpG, susceptible de presentar metilación, que contiene secuencias específicas como sitios de unión a factores de trascripción. Sin embargo, tras las PCRs específicas de metilación, no se han encontrado indicios de metilación en los pacientes ni en los controles. Tras el análisis de polimorfismos en los moduladores genéticos SERT (c.1-1853_1897del44), EDN1 (c.5665G>T), NOS2 (CCTTT) AGTR1 (c.1166A>C) y TRPC6 (c.1-361A>T, c.1-254C>G y c.1-218C>T) se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre pacientes y controles para todos excepto para el gen SERT. Sin embargo, tan solo el polimorfismo c.1166A>C, del gen AGTR1, y los polimorfismos c.1-361A>T, c.1-254C>G y c.1-218C>T, del gen TRPC6, mostraton diferencias estadísticamente significativas en la correlación genotipo-fenotipo. El 27% de los pacientes eran portadores de los 3 polimorfismos del gen TRPC6 y del polimorfismo AGTR1 y tras la correlación genotipo-fenotipo de estos pacientes, encontramos diferencias estadísticamente significativas para la edad de diagnóstico, siendo más temprana en estos pacientes (p=0´049). También muestran valores más altos de la PaPm (p=0´033) y valores más bajos para el IC (p=0´002) y TM6M (p=0´039). Para concluir, el análisis mutacional de los genes BMPR2, ACVRL1, ENG y KCNA5, se confirma la HAP como una patología oligogénica en donde la baja penetrancia de BMPR2 podría estar explicada por la implicación de otros genes. Otros genes no analizados o no relacionados todavía con la HAP podrían estar involucrados aumentando el número de genes implicados en esta patología. Los análisis in silico de los cambios encontrados ayudan a predecir el caracter patogénico de una variante, sin embargo los estudios funcionales mediante la actividad luciferasa, minigenes híbridos y estudios de localización subcelular son una buena aproximación para conocer el carácter patogénico real de las mutaciones identificadas. El patrón de metilación de la región promotora del gen BMPR2 no parece estar relacionado con la penetrancia de la HAP y, finalmente, los moduladores genéticos juegan un importante papel modulando el fenotipo de la patología, en combinación con los demás genes descritos.