Caracterización clínica y molecular de la enfermedad de Stargardt y formas asociadasaplicación de nuevas técnicas moleculares

Abstract

I - INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1- El ojo humano .........................................................................................1 1.1- Desarrollo embrionario del ojo ........................................................1 1.2- Funciones del ojo ............................................................................3 1.3- Estructura del ojo ............................................................................3 1.3.1- La retina ...............................................................................5 1.3.1.1- Estructura macroscópica.......................................6 1.3.1.2- Estructura microscópica ........................................7 1.3.1.3- El proceso de fototransducción ..........................14 1.4- Funcionamiento del ojo ...............................................................17 2- La genética humana .............................................................................18 3- Enfermedades raras de origen genético ............................................20 4- Retinopatías hereditarias ....................................................................21 4.1- Introducción 21 4.2- Heterogeneidad de las retinopatías hereditarias ................................22 4.2.1- Heterogeneidad clínica ......................................................22 4.2.2- Heterogeneidad genética ...................................................24 4.2.3- Heterogeneidad en el patrón de herencia ..........................25 5- Retinopatías hereditarias centrales: Distrofias maculares ..............28 6- Diagnóstico oftalmológico...................................................................28 6.1- Antecedentes personales y familiares ................................................29 6.2- Exploración oftalmológica ..................................................................30 Tesis Doctoral Índice 7- Enfermedad de Stargardt .....................................................................32 7.1- Rasgos clínicos ..................................................................................33 7.2- La proteína: ABCA4/RmP ..................................................................34 7.3- El gen: ABCA4 ....................................................................................37 7.4- Variantes alélicas de ABCA4 .............................................................37 7.4.1- Fenotipos asociados a ABCA4 ................................................39 8- Aproximaciones Terapeúticas ............................................................41 8.1- Terapia génica ...................................................................................41 8.2- Tecnología de células encapsuladas .................................................42 8.3- Remodelación de la retina en modelos animales ...............................42 8.4- Retina artificial ....................................................................................43 8.5- Células madre ....................................................................................44 II- OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 III- PACIENTES Y MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 1- Pacientes y familas estudiadas...........................................................47 1.1- Procedencia de los pacientes .............................................................47 1.2- Evaluación clínica ...............................................................................47 1.3- Clasificación clínica de las familias estudiadas ..................................47 2- Metodología ...........................................................................................72 2.1- Obtención de ADN genómico .............................................................72 2.1.1- Extracción de ADN genómico .............................................72 2.1.1.1- Extracción de ADN por el método salino.............72 2.1.1.2- Extracción automática de ADN ...........................72 2.1.2- Cuantificación del ADN .......................................................73 2.2- Estudio genético directo......................................................................75 Tesis Doctoral Índice 2.2.1- Cribado de mutaciones mediante microarray de genotipado ..........................................................................76 2.2.2- Reacción en cadena de la polimerasa: PCR ......................76 2.2.2.1- Condiciones de la PCR .......................................77 2.2.2.2- Cebadores en la reacción de amplificación.........77 2.2.3- Purificación del producto de PCR .......................................79 2.2.3.1- Purificación a partir del producto de PCR ...........82 2.2.3.2- Purificación a partir de gel de agarosa................80 2.2.3.2.1- Purificación manual ........................82 2.2.3.2.2- Purificación automática .......................83 2.2.4- Secuenciación automática ..................................................83 2.2.4.1- Reacción de secuenciación.................................83 2.2.4.2- Purificación del producto secuenciado................84 2.2.5- Técnica de dHPLC (denaturing High Performance Liquid Chromatography) ....................................................86 2.2.6- Técnica de HRM (High Resolution Meeting).......................90 2.2.7- Técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ...........................................................94 2.2.8- Análisis con enzimas de restricción ....................................96 2.3- Estudio genético indirecto...................................................................98 2.3.1- Reacción en cadena de la polimerasa: PCR ......................98 2.3.1.1- Condiciones de la PCR .......................................98 2.3.1.2- Cebadores en la reacción de amplificación.........99 2.3.2- Análisis de haplotipos .......................................................100 2.3.3- Diseño de árboles genealógicos.......................................100 2.4- Análisis de marcadores intragénicos ................................................101 2.5- Herramientas bioinformáticas ...........................................................101