Análisis del papel del sistema kiss1/kisspeptinas en el control de la función metabólicaestudios farmacológicos y de genómica funcional

Abstract

1. INTRODUCCIÓN Hoy en día, la obesidad y las enfermedades asociadas ésta, están alcanzando proporciones epidémicas en todo el mundo, y esto se debe a la incapacidad del individuo para preservar la homeostasis energética debido a la continua exposición a condiciones obesogénicas que le rodean. Un balance energético adecuado depende del equilibrio entre el gasto energético y la ingesta de alimentos [1, 2]. La regulación de estos procesos biológicos depende de un complejo sistema de señalización que, a nivel periférico, informa de manera precisa de la disponibilidad de recursos con los que el individuo cuenta en todo momento, y que a nivel central incorpora multitud de circuitos neuronales y hormonales, que integran toda la información y responden de manera adecuada a los cambios energéticos del organismo. La reproducción, aun cuando no es fundamental para la supervivencia del individuo, es una función vital para la supervivencia de las especies, y dada su importancia, los organismos se han dotado de numerosos sistemas de control que aseguran que ésta se lleve a cabo de manera adecuada. Además, la activación del eje reproductor depende en gran medida del grado de reservas energéticas del individuo, de manera que solo en caso de suficiencia energética la función reproductora se pone en marcha durante la pubertad y se mantiene durante la edad adulta [3, 4]. Sin embargo, en situaciones de exceso o déficit de reservas energéticas, como es el caso de la obesidad extrema y la subnutrición, respectivamente, la función reproductora puede verse severa-mente afectada. Asimismo, las alteraciones en la edad de adquisición de la capacidad reproductora, ya sea porque la pubertad tenga lugar a edades muy tempranas o tardías, predispone al desarrollo de numerosos problemas de salud durante el período adulto, tales como cardiopatías, diabetes tipo II, cáncer o trastornos neuromusculares, disminuyendo ostensiblemente la esperanza de vida. El correcto funcionamiento del eje reproductor depende de la integración de las señales metabólicas periféricas que convergen a nivel central y actúan sobre los distintos centros hipotalámicos responsables de la reproducción. Estos mecanismos reguladores implican a un gran número de, por un lado, hormonas metabólicas, entre las que cabe destacar la leptina (señal de suficiencia energética sintetizada en el tejido adiposo) [6, 7] y la ghrelina (señal de déficit energético) [8, 9]y por otro lado neuropéptidos como, entre otros, las Kisspeptinas. Las kisspeptinas (codificadas por el gen Kiss1) y su receptor Gpr54 (o KISS1R), son elementos clave en la regulación del eje reproductor [10]. Tanto es así, que se ha documentado de manera concluyente que mutaciones en los genes Kiss1 o Gpr54, tanto en humano como en ratón, causan ausencia de pubertad y desordenes reproductores tales como el hipogonadismo hipo-gonadotropo [11, 12]. Las kisspeptinas actúan a través de Gpr54 estimulando la secreción de las neuronas GnRH en el hipotálamo y activando así el eje reproductor (eje Hipotálamo-Hipófiso-Gonadal). Además, las kisspeptinas tienen un papel fundamental en la integración de la información metabólica a nivel central [13]. Así, cambios en el estatus metabólico afectan a los niveles de kisspeptinas en el hipotálamo, lo que sugiere que las neuronas Kiss1 intervienen en el control metabólico de la reproducción [14]. Sin embargo, la distribución del receptor de las kisspeptinas no se circunscribe al área hipotalámica, sino que puede encontrarse en otras áreas del cerebro y en diversos tejidos periféricos, incluyendo tejidos metabólicos como la grasa o el páncreas [15]. Todas estas evidencias previas sugieren que las kisspeptinas podrían tener también un papel directo en el control de determinados parámetros metabólicos, más allá de su papel en la función reproductora. En este sentido, estudios recientes han sugerido la posible implicación de las kisspeptinas en el control de parámetros metabólicos tales como el peso corporal [16, 17], la ingesta o la actividad locomotora [18, 19]. Sin embargo, la evidencia acerca de una función metabólica genuina de las kisspeptinas sigue siendo, en muchos casos, inconclusa, lo que hace obligatorio el uso de enfoques adicionales más incisivos, para exponer plenamente las acciones fisiológicas, y el posible papel patogénico, de la señalización de las kisspeptinas en el control de las facetas clave del metabolismo. Teniendo en cuenta lo expuesto previamente, el objetivo general de esta Tesis Doctoral es el estudio del papel del sistema Kiss1 en la regulación de aspectos básicos de la función metabólica en ambos sexos, mediante el empleo de herramientas farmacológicas y modelos murinos genéticamente modifica-dos (genómica funcional). 2. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN Esta Tesis Doctoral se ha dividido en tres bloques experimentales principales. En el bloque experimental 1, se ha evaluado las respuestas de parámetros metabólicos básicos a la administración central o periférica de Kp-10 en ratones silvestres. Nuestros resultados mostraron, en primer lugar, que la administración repetida intracerebroventricular de Kp-10 indujo alteraciones detectables de diversos parámetros metabólicos, con un perfil claramente diferenciado en función del sexo. Así, en machos, la inyección repetida central de Kp-10 produjo una caída conjunta de la ingesta de alimentos, así como del gasto energético y la actividad locomotora, con una moderada elevación del RQ, indicativa de un cambio al uso predominante de carbohidratos como sustrato energético. Sin embargo, estas alteraciones no se tradujeron en cambios detectables en el peso y composición corporal, posiblemente por la supresión paralela de ingesta y consumo energético, ni en alteraciones de la homeostasis glucídica, con niveles de glucemia basal y respuestas en los test de tolerancia a la glucosa (GTT) y a la insulina (ITT) similares a las de ratones macho tratados con vehículo. Por el contrario, en ratones hembra, la inyección central repetida de Kp-10 no produjo cambios significativos en la ingesta de alimentos y causó un incremento del gasto energético y la actividad locomotora, que se asociaron a una tendencia a la disminución del peso corporal, principalmente a expensas de una modesta reducción de la masa magra. Adicionalmente, el tratamiento central con Kp-10 provocó una disminución de los niveles de glucemia basal, sin cambios detectables en las respuestas a GTT e ITT. Por otra parte, la administración periférica de Kp-10 no provocó cambios en ninguno de los parámetros analizados tanto en ratones macho como en hembras, a excepción de una ligera mejor en la resistencia a insulina. En el bloque experimental 2, a fin de profundizar en la definición de los efectos directos de las kisspeptinas sobre el metabolismo, diferenciándolos frente a aquellos derivados de sus acciones sobre la función gonadal, se ha llevado a cabo el análisis metabólico de un modelo de ratón con inactivación genética global del receptor de kisspeptinas, Gpr54, y con reinserción selectiva del receptor solo en neuronas GnRH, permitiendo así un rescate completo de la maduración puberal y de la función del eje gonadal. Nuestros resultados en ratones alimentados con dieta control detectaron una bajada consistente de peso corporal en los machos Gpr54-/-, posiblemente debido a la ausencia del efecto anabolizante de los andrógenos, mientras que las hembras Gpr54-/- mostraron un incremento del peso corporal, principalmente durante la etapa adulta, que a su vez está relacionado con un aumento en la adiposidad, que se manifiesta en un incremento de los niveles de leptina, así como con una disminución de la expresión génica de factores termogénicos, tales como UCP1 en el tejido adiposo marrón. Por su parte, los ratones Gpr54-/-Tg (rescatados, y por tanto con función gonadal preservada) mostraron un fenotipo similar a los controles en peso corporal a tiempo final. Sin embargo, en machos se detectó un perfil de peso intermedio que se hizo evidente en las primeras etapas del desarrollo. Igualmente, se analizaron los patrones de ingesta y se observó que, en machos, solo los ratones Gpr54-/- mostraron una supresión significativa de la ingesta, tanto en la fase de luz como en la fase oscura, mientras que los ratones Gpr54-/-Tg presentaron unos patrones de ingesta iguales a los controles. En hembras, la ingesta de las ratonas Gpr54-/- presentó una disminución significativa, tanto en la fase de luz como en oscuridad, al igual que en machos con KO global de Gpr54. Sin embargo, la ingesta también fue parcialmente suprimida solo en las hembras Gpr54-/-Tg, y no en los ratones macho rescatados. En cuanto al metabolismo de la glucosa, observamos un deterioro en la tolerancia a glucosa que fue detectable sólo en las hembras, siendo las hembras KO las que mostraron un mayor empeoramiento en el manejo de la glucosa, mientras que las hembras rescatadas presentaron un fenotipo intermedio entre las hembras KO y control. Además, nuestro estudio ha sido el primero en explorar el impacto de la manipulación de la señalización de kisspeptinas sobre el peso corporal y la respuesta metabólica en animales sometidos a diferentes insultos obesogénicos, como el HFD y la gonadectomía, este último en ratones hembra. Nuestros datos indican que la ausencia de la señalización de kisspeptinas a nivel global causa un deterioro exagerado de parámetros metabólicos clave tras la exposición a estas condiciones obesogénicas, con un aumento de la ganancia de peso corporal y de la masa grasa, una disminución de la masa magra y un empeoramiento de la tolerancia a la glucosa. Por último, en el tercer bloque experimental de esta Tesis, empleamos un modelo murino novedoso, generado por nuestro grupo, el ratón TaKKO, que presenta eliminación selectiva de la expresión del gen Kiss1 en células que expresan Tac2, y por ello en las neuronas KNDy del ARC, con el fin de dilucidar las posibles acciones metabólicas de las kisspeptinas producidas por esta población neuronal clave. Los ratones TaKKO mostraron un aumento significativo de la adiposidad a distintas edades del crecimiento, tanto en ratones macho como hembra, siendo más evidente dicho efecto en estas últimas. Por otra parte, la eliminación de la producción de kisspeptinas en neuronas KNDy del ARC no provoco cambios significativos en los patrones de ingesta en machos o hembras, si bien los ratones TaKKO de ambos sexos presentaron una tendencia (que no alcanzó la significación estadística) a una reducción de la ingesta, especialmente en la fase de oscuridad en hembras y en la ingesta acumulada en 24h en machos. Además, nuestros resultados evidencian una supresión del gasto energético en los ratones TaKKO, que fue significativa en machos, y que se asoció a una disminución del peso de BAT en ambos sexos, así como una disminución de la actividad locomotora selectivamente en las hembras TaKKO. Por último, nuestros análisis detectaron alteraciones sutiles en los perfiles de glucemia tras la sobrecarga de glucosa o insulina en ratones TaKKO, especialmente en machos, donde la ablación selectiva de kisspeptinas de las neuronas KNDy indujo una mejora moderada del manejo de glucosa tras la sobrecarga e incluso aumentó ligeramente la sensibilidad a insulina, al menos a determinados tiempos durante el GTT y el ITT. 3. CONCLUSIONES Las principales conclusiones de nuestro trabajo son: 1- La administración farmacológica central, pero no periférica, de kisspeptina-10, causó una supresión concurrente de la ingesta, el gasto energético y la actividad locomotora en ratones macho, mientras que indujo un aumento del gasto energético y la actividad locomotora, junto a una moderada disminución del peso corporal, en ratones hembra, de manera independiente de cambios en los niveles de esteroides sexuales. 2- La ablación congénita del receptor de kisspeptinas indujo cambios en el peso y la composición corporal, la ingesta y la homeostasis glucídica, y agravó el impacto metabólico de manipulaciones obesogénicas, como la dieta alta en grasa y la ovariectomía. Aunque una parte notable de esos efectos parece derivar del estado de hipogonadismo asociado a la eliminación de la señalización de kisspeptinas, nuestros estudios en modelos con ablación condicional de Gpr54 ponen de manifiesto un papel primario de este sistema en el control del peso corporal en periodos pre/peri-puberales, el control de la ingesta y la homeostasis glucídica, especialmente en hembras, así como en la adaptación a insultos obesogénicos, especialmente en machos. 3- La eliminación selectiva de las kisspeptinas procedentes de neuronas KNDy produjo alteraciones en la composición corporal, con aumento de la adiposidad y descenso del gasto energético en ambos sexos, y una alteración sexualmente dimórfica de la actividad locomotora (disminuida en hembras) y de la homeostasis glucídica (con mejoras moderadas de los perfiles de tolerancia a glucosa e insulina en machos). 4- Globalmente, nuestros resultados documentan un papel fisiológico de la señalización de kisspeptinas en la regulación del peso y composición corporal, la ingesta de alimentos, el gasto energético, la actividad locomotora, la homeostasis glucídica y las respuestas metabólicas a los insultos obesogénicos. Estos efectos, sin embargo, dependen del sitio de acción y, en algunos casos, se presentan de manera sexualmente dimórfica.   BIBLIOGRAFÍA [1] M.A. Rossi, G.D. Stuber, Overlapping Brain Circuits for Homeostatic and Hedonic Feeding, Cell Metab 27(1) (2018) 42-56. [2] H. Münzberg, E. Qualls-Creekmore, H.R. Berthoud, C.D. Morrison, S. Yu, Neural Control of Energy Expenditure, Handb Exp Pharmacol 233 (2016) 173-94. [3] M. Manfredi-Lozano, J. Roa, M. Tena-Sempere, Connecting metabolism and gonadal function: Novel central neuropeptide pathways involved in the metabolic control of puberty and fertility, Front Neuroendocrinol 48 (2018) 37-49. [4] M.S. Avendaño, M.J. Vazquez, M. Tena-Sempere, Disentangling puberty: novel neuroendocrine pathways and mechanisms for the control of mammalian puberty, Hum Reprod Update 23(6) (2017) 737-763. [6] M.J. Vázquez, A. Romero-Ruiz, M. Tena-Sempere, Roles of leptin in reproduction, pregnancy and polycystic ovary syndrome: consensus knowledge and recent developments, Metabolism 64(1) (2015) 79-91. [7] J. Roa, M. Tena-Sempere, Connecting metabolism and reproduction: roles of central energy sensors and key molecular mediators, Mol Cell Endocrinol 397(1-2) (2014) 4-14. [8] R. Fernández-Fernández, M. Tena-Sempere, V.M. Navarro, M.L. Barreiro, J.M. Castellano, E. Aguilar, L. Pinilla, Effects of ghrelin upon gonadotropin-releasing hormone and gonadotropin secretion in adult female rats: in vivo and in vitro studies, Neuroendocrinology 82(5-6) (2005) 245-55. [9] M.C. Lebrethon, A. Aganina, M. Fournier, A. Gérard, A.S. Parent, J.P. Bourguignon, Effects of in vivo and in vitro administration of ghrelin, leptin and neuropeptide mediators on pulsatile gonadotrophin-releasing hormone secretion from male rat hypothalamus before and after puberty, J Neuroendocrinol 19(3) (2007) 181-8. [10] L. Pinilla, E. Aguilar, C. Dieguez, R.P. Millar, M. Tena-Sempere, Kisspeptins and reproduction: physiological roles and regulatory mechanisms, Physiol Rev 92(3) (2012) 1235-316. [11] N. de Roux, E. Genin, J.C. Carel, F. Matsuda, J.L. Chaussain, E. Milgrom, Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54, Proc Natl Acad Sci U S A 100(19) (2003) 10972-6. [12] S.B. Seminara, S. Messager, E.E. Chatzidaki, R.R. Thresher, J.S. Acierno, J.K. Shagoury, Y. Bo-Abbas, W. Kuohung, K.M. Schwinof, A.G. Hendrick, D. Zahn, J. Dixon, U.B. Kaiser, S.A. Slaugenhaupt, J.F. Gusella, S. O'Rahilly, M.B. Carlton, W.F. Crowley, S.A. Aparicio, W.H. Colledge, The GPR54 gene as a regulator of puberty, N Engl J Med 349(17) (2003) 1614-27. [13] F. Wahab, B. Atika, F. Ullah, M. Shahab, R. Behr, Metabolic Impact on the Hypothalamic Kisspeptin-Kiss1r Signaling Pathway, Front Endocrinol (Lausanne) 9 (2018) 123. [14] J.M. Castellano, V.M. Navarro, R. Fernández-Fernández, J. Roa, E. Vigo, R. Pineda, C. Dieguez, E. Aguilar, L. Pinilla, M. Tena-Sempere, Expression of hypothalamic KiSS-1 system and rescue of defective gonadotropic responses by kisspeptin in streptozotocin-induced diabetic male rats, Diabetes 55(9) (2006) 2602-10. [15] A. Wolfe, M.A. Hussain, The Emerging Role(s) for Kisspeptin in Metabolism in Mammals, Front Endocrinol (Lausanne) 9 (2018) 184. [16] K.P. Tolson, C. Garcia, S. Yen, S. Simonds, A. Stefanidis, A. Lawrence, J.T. Smith, A.S. Kauffman, Impaired kisspeptin signaling decreases metabolism and promotes glucose intolerance and obesity, J Clin Invest 124(7) (2014) 3075-9. [17] K.P. Tolson, C. Garcia, I. Delgado, N. Marooki, A.S. Kauffman, Metabolism and Energy Expenditure, But Not Feeding or Glucose Tolerance, Are Impaired in Young Kiss1r KO Female Mice, Endocrinology 157(11) (2016) 4192-4199. [18] R. Saito, K. Tanaka, H. Nishimura, K. Nishimura, S. Sonoda, H. Ueno, Y. Motojima, M. Yoshimura, T. Maruyama, Y. Yamamoto, K. Kusuhara, Y. Ueta, Centrally administered kisspeptin suppresses feeding via nesfatin-1 and oxytocin in male rats, Peptides 112 (2019) 114-124. [19] S.L. Padilla, J.G. Perez, M. Ben-Hamo, C.W. Johnson, R.E.A. Sanchez, I.L. Bussi, R.D. Palmiter, H.O. de la Iglesia, Kisspeptin Neurons in the Arcuate Nucleus of the Hypothalamus Orchestrate Circadian Rhythms and Metabolism, Curr Biol 29(4) (2019) 592-604.e4.