Estudio de los elementos reguladores de la embriogénesis nkx2-1, nanci y hottip en estadios precoces de cáncer de pulmón de célula no pequeña

Resumen

Los avances en las técnicas de estudio genético han permitido demostrar una estrecha relación entre los genes embrionarios y tumorales. La comprensión de los mecanismos que regulan la embriogénesis y se "desregulan" durante la oncogénesis abren un horizonte en la investigación del cáncer. En los trabajos incluidos en esta tesis exploramos el papel pronóstico de dos factores de transcripción embrionarios, el gen NKX2·1 y el lncRNA HOffiP re-expresados en pacientes con CPCNP resecable. En el primer trabajo nos centramos en el estudio de NKX2-1, al tratarse de un gen que regula el desarrollo pulmonar, su expresión evaluada por IHQ está ampliamente extendida para la identificación de ADK de origen pulmonar y existen reportes de su valor pronóstico en CPCNP con resultados discrepantes: autores que relacionaron la expresión aumentada de NKX2-1 con un mejor pronóstico,que no encontraron diferencias significativas en la supervivencia global y autores que relacionaron la expresión aumentada de NKX2·1 con un peor pronóstico. Estos hallazgos podrían explicarse en primer lugar, debido a que la mayoría de estudios evaluaron la expresión de NKX2·1 mediante IHQ una técnica que detecta la presencia de la proteína analizada de manera cualitativa y en segundo lugar, la heterogeneidad en cuanto se refiere al estadiaje de la enfermedad en las cohortes analizadas. Por lo tanto, nos propusimos evaluar la expresión de NKX2-1 mediante RT-PCR, una técnica que tiene una sensibilidad muy elevada y permite la cuantificación de la expresión de mRNA de NKX2-1 en una cohorte de 110 pacientes con estadios precoces de CPCNP bien caracterizada clínica y molecularmente. Detectamos expresión de NKX2-1 en SCC en línea con reportes previos, como era de esperar, esta expresión era significativamente menor en comparación a la del tipo histológico de ADK (P<0,0001). Estudiamos la presencia de mutación de p53 al tratarse de una mutación frecuente, presente hasta en el 39% de los ADK, tratarse de un gen que codifica una proteína supresora de tumores y se ha descrito que su transcripción estaría regulada por NKX2-1 vía represión de LKBl a través de la inactivación de IKKl3/NF-KB. En nuestra cohorte, los pacientes que no presentaban la mutación de TP53 tenían niveles de expresión de NKX2-1 superiores en comparación a los niveles de los pacientes con la mutación(P=0,001). No encontramos diferencias significativas cuando analizamos la expresión de NKX2-1 según el estado mutacional de KRAS y EGFR. Cuando analizamos el impacto pronostico de NKX2-1 en CPCNP confirmamos que la expresión aumentada de NKX2-1 en estadios precoces de CPCNP (1-II) se asocia a una mayor SG (P=0,035) en toda la cohorte y en el subgrupo limitado a estadios I P=0,031). De manera interesante, identificamos la expresión de NKX2-1 en pacientes sin mutación de TPS3 ni KRAS como factor independiente asociado a la SG (HR 5,335; P=0,018) y SLE (HR 4,333, P=0.008). El mecanismo mediante el cual NKX2-1 actúa como supresor tumoral no esta completamente dilucidado, especulamos que la regulación epigenética por RNA no codiflcantes podría ser fundamental para comprender su funcionalidad. Por lo tanto, estudiamos los dos miRNAs descritos en estudios "in silico" y líneas celulares relacionados a NKX2-l. miR-365 y miR-33a, el primero regula la expresión de NKX2-1137 y el segundo es directamente regulado por NKX2-1138. Encontramos una correlación inversa entre los niveles de expresión de NKX2-1 y miR-365. La expresión elevada de miR-365 mostró una tendencia a una menor SG (P=0,073), sugiriendo un rol regulatorio de miR-365 sobre NKX2-1. En contraste, la correlación entre NKX2-1 y miR-33a no fue significativa sugiriendo que otros factores condicionarían la regulación de miR-33a además de NKX2-1. En el segundo trabajo, analizamos el lncRNA HOTTIP que tiene una función como factor de transcripción durante el proceso embrionario participando en la diferenciación de tejidos con componentes mesodermicos, entre los cuales se encuentra el tejido pulmonar, actuando en la regulación de las interacciones epitelio­mesenquimales. La expresión elevada de HOTTIP está asociada a un peor pronóstico en hepatocacinoma, SCC lingual, cáncer colorectal, osteosarcoma, cáncer de mama, cáncer gástrico y CPCP. En este trabajo estudiamos la expresión de HOTTIP en 99 pacientes con estadios precoces (I-11) de CPCNP y describimos por primera vez su impacto pronóstico. HOTTIP estaba sobreexpresado en SCC (P=O 007) y pacientes fumadores (P=0,018). La expresión elevada de HOmP se asoció a un menor TLE (P=0,05) y una menor SG (P=0,04) en estadios precoces de CPCNP. En el análisis multivariado, HOTTIP emergió como un factor pronóstico independiente en este grupo de pacientes. Utilizando como serie de validación los datos de TGCA mediante la webtool TANRIC 195 validamos el impacto pronóstico de HOTTIP demostrando que su expresión aumentada en la cohorte de 91 estadios I-11 de ADK se asoció a una menor SG (P=0,0025), sin encontrar diferencias significativas en SCC. Finalmente, teniendo en cuenta que se han descrito interacciones entre lncRNA, mRNAs y miRNAs exploramos los posibles genes que estarían relacionados a HOTTIP utilizando los datos de TGCA. Identificamos una firma de 1203mRNAs y 61 miRNAs. La mayoría de los mRNA identificados estaban relacionados a la red de genes HOX incluyendo HOXA9, HOXAlO, HOXA 11, HOXA 13, HOXB13. Existen reportes de que la interacción entre HOTTIP y algunos de los genes HOX juegan un papel en la oncogénesis en diversos cánceres. De manera interesante el análisis de red identificó una reglón de interacción potencial que incluía el gen HOXP, un factor de transcripción relacionado a la diferenciación alveolar, su supresión se asocia a una mayor desdiferenciación y a una mayor capacidad metastasica196. Encontramos una correlación negativa entre HOTTIP y HOXP lo que podría explicar que los niveles bajos de HOTTIP estén asociados a un peor pronóstico. Cuando exploramos los miRNA identificamos una correlación positiva con miR-196b localizado en la parte distal del cluster HOXA y miR-196a-1 localizado en el cluster HOXB. Estos análisis ponen de manifiesto potenciales vías de regulación de HOTTIP en CPNCP. En el tercer trabajo, evaluamos la expresión de NANCI (NKX2-1 asociado no codificante RNA intergenico) que se encuentra espacialmente cerca del factor de transcripción NKX2-1 y que lo regula actuando en cis, y por bucle de retroalimentación es regulado por NKX2-1, indicando que el dúplex NANCI/NKX2-1 es esencial para la expresión de NKX2-1. Limitamos el estudio a estadios I e incrementamos la serie a 98 pacientes. Encontramos que existía una correlación significativa entre los niveles de NANCI y NKX2-1. Ambos estaban sobreexpresados en el ADK en comparación con SCC. Los pacientes fumadores activos o exfumadores mostraron unos niveles de NKX2-1 significativamente menores a los niveles detectados en pacientes nunca fumadores, este hallazgo va en línea de lo reportado en estudios previos que sugieren que NKX2-1 estaría desregulado por el tabaco. Sin embargo, a pesar de la fuerte correlación entre NKX2-1 y NANCI, la expresión de NANCI no se vio afectada por el habito tabáquico. Validamos los hallazgos del primer trabajo en lo que se refiere al impacto pronóstico de NKX2-1 en estadio I de CPCNP confirmando que una expresión mayor de NKX2-1 se asocia a un mejor pronostico en estos pacientes. De manera similar, los pacientes tienen niveles elevados de expresión de NANCI tuvieron una mayor SG (P=0,021) y SLE (P=0,032). Cuando analizamos el efecto del dúplex NANCI/NKX2-1 identificamos 4 grupos de pacientes: expresión NANCI alto/ NKX2-1 alto, NANCI bajo /NKX2-1 alto, NANCI alto/NKX2-1 bajo y NANCI bajo /NKX2-1 bajo. El grupo de pacientes con expresión elevada del dúplex (NANCI alto/ NKX2-1 alto) emergieron como un factor pronostico independiente para SG (HR: 0,309, P=0,014) y SLE (HR: 0,346, P=0,004). En este mismo trabajo analizamos la expresión del dúplex NANCI/NKX2-1 en 18 embriones de 8 a 13 semanas de desarrollo y tejido no tumoral (NT). Demostramos que la expresión de NANCI y NKX2-1 estaba presente en embriones de 8 semanas con un incremento progresivo de su expresión durante el desarrollo hasta tener los niveles mas elevados en tejido NT. De forma interesante, la expresión del dúplex NANCI/NKX2-1 en pulmón embrionario de 8 semanas comparte similitudes con el grado de expresión en el CPCNP, estos datos refuerzan la idea de que la ambos procesos tienen similitudes en el grado de desdiferenciación, sin embargo el carácter "desordenado" de esta favorecería el desarrollo tumoral .