Novel Approaches for Molecular Diagnosis of Genetic Diseases by Next Generation SequencingApplication to Breast Cancer and Retinitis Pigmentosa in the Clinical Practice

Resumo

En la pràctica clínica actual existeix una demanda creixent d’estudis moleculars de malalties genètiques. Generalment, la detecció de mutacions patològiques en gens candidats consisteix en la seqüenciació directa dels exons i les zones intròniques flanquejants mitjançant el mètode de Sanger, el qual es basa en una electroforesi capil·lar i requereix l’amplificació prèvia de cada fragment d’ADN en una reacció de PCR individual. Així, l’anàlisi de gens formats per molts exons com BRCA1 i BRCA2, associats a càncer de mama i ovari, implica un elevat nombre de reaccions de PCR i seqüenciació, i esdevé una tasca molt costosa en termes de temps i diners. D’altra banda, l’estudi de malalties monogèniques genèticament heterogènies, com és el cas de la Retinosi Pigmentària autosòmica dominant (RPad), pot requerir l’anàlisi de més de 20 gens per tal d’identificar la causa molecular de la malaltia. Tot i així, només un 20-30% dels pacients amb RPad són diagnosticats molecularment ja molts gens i mutacions associades a la malaltia són encara desconeguts. D’aquí que l’ús de les tècniques de seqüenciació massiva d’ADN o seqüenciació de nova generació (NGS) sigui una pràctica cada vegada més habitual en els laboratoris de genètica molecular. Per a l’estudi de diversos pacients en paral·lel o per a analitzar exomes complets amb la finalitat de trobar nous gens associats a RPad, existeixen grans plataformes de seqüenciació massiva. No obstant, l’elevat cost i la gran capacitat d’aquestes plataformes es tradueix en una pèrdua de flexibilitat a l’hora de satisfer la necessitat de molts laboratoris de genètica, que sovint han d’analitzar la mostra d’un o pocs individus en un temps i amb un cost raonablement reduïts. Com a conseqüència, les empreses tecnològiques que treballen amb equips de NGS han introduït al mercat petites plataformes adaptades a l’ús clínic. Una d’aquestes plataformes, el GS Junior, ha demostrat amb èxit el seu potencial per al diagnòstic en laboratoris de genètica molecular. Amb la mateixa tecnologia bàsica que el GS 20 i GS FLX, la plataforma GS Junior utilitza les tècniques de PCR en emulsió i piroseqüenciació, però suposa una menor despesa tant de posada en marxa com de funcionament. Aquest treball de recerca té com a objectiu provar i posar a punt tecnologies de NGS per tal d’obtenir diagnòstics moleculars a uns costos assumibles. Amb aquesta finalitat i per a l’estudi dels gens BRCA1 i BRCA2, es va idear un protocol de PCR llarga associat a dos mètodes enzimàtics de fragmentació d'ADN per tal d’obtenir biblioteques d’ADN preparades per a ser analitzades amb NGS. A més, es van assajar diferents mètodes basats en PCR llarga, multiplex o en emulsió, i en captura d’ADN per a detectar mutacions causants d’RPad. A més, aprofitant la reducció del preu per megabase seqüenciada, també es va fer seqüenciació massiva de l’exoma. L'eficiència de les diferents metodologies avaluades ha permès crear nous protocols de treball que ja han estat implementats en la rutina del laboratori. Per tal de caracteritzar nous gens associats a RPad, es va utilitzar la NGS per analitzar un array de captura de 448 gens candidats en diverses famílies i l’exoma complet d’una d’elles. Es va observar que els pacients analitzats presentaven un gran nombre de variants. Per a poder establir el paper d’aquestes variants com mutacions causants de la malaltia, és imprescindible efectuar la segregació familiar; per tant, la validació dels resultats només es podia aconseguir en famílies amb almenys dos individus afectats i un membre no afectat. D’aquesta manera, en la seqüenciació de l’exoma, es van trobar més de 150 variants genètiques que podrien ser les causants de la RPad en la família.