Sensibilidad antifúngica de los dermatofitos

Abstract

Los dermatofitos son hongos filamentosos que causan infecciones en la piel, el pelo y las uñas tanto del ser humano como de los animales. Aunque las dermatofitosis suelen estar restringidas a las capas superficiales de la piel y sus apéndices, también pueden afectar la dermis y el tejido subcutáneo y así causar granulomas o pseudomicetomas. Algunos profesionales de las ciencias de la salud consideran las dermatofitosis como un problema meramente estético. Sin embargo, el impacto real que tienen estas infecciones sobre la calidad de vida de los pacientes es considerable. Los pacientes están afectados físicamente (sienten dolor, prurito, molestias), socialmente (sienten vergüenza al ser considerados personas de malos hábitos de higiene o como fuentes de infección) o laboralmente (los manipuladores de alimentos o personas que trabajan de cara al público, etc. pueden ver sus carreras truncadas o condicionadas). Este problema es especialmente importante en pacientes con dermatofitosis crónicas como las onicomicosis o tinea pedis. En el caso de las onicomicosis, el fracaso terapéutico puede llegar al 25% y en el caso de tinea pedis, especialmente el tipo mocasín, la infección puede persistir durante años y las recidivas son frecuentes en un 70% de los pacientes. Como las dermatofitosis tienden a ser crónicas (las pautas de tratamiento suelen ser prolongadas) y la terapia disponible es poco efectiva, el consumo de antifúngicos y por tanto el gasto sanitario se ven incrementados. Por ejemplo, en nuestro país el consumo anual de antifúngicos tópicos genera un gasto aproximado de 36 millones de euros y el de antifúngicos sistémicos genera un gasto que puede superar los 27.000 euros. Con el fin de frenar esta problemática, nuevos antifúngicos están siendo desarrollados, lo que ha generado un gran interés en poder evaluar de forma reproducible la sensibilidad de los dermatofitos a los antifúngicos. Sin embargo, en la actualidad no existen métodos de referencia para éstos hongos. En la presente tesis doctoral, desarrollamos y estandarizamos varios métodos que demuestran ser prácticos y útiles para determinar la sensibilidad de los dermatofitos a los antifúngicos. Estos métodos son: microdilución en caldo, Sensititre Yeast One(r), dilución en agar, Etest(r) y el método de difusión con discos. Dichos métodos han sido evaluados usando un extenso número de cepas de dermatofitos, incluyendo casi todas las especies que conforman este grupo de hongos, y un gran número de antifúngicos, bien ya comercializados o de nueva síntesis experimental. Nuestros resultados aportan a la ciencia la primera base de datos sobre estudios de reproducibilidad intra- e interlaboratorio para evaluar las condiciones óptimas de ensayo del método de microdilución para determinar la sensibilidad de los dermatofitos a los antifúngicos más usados en la clínica como el itraconazol, la terbinafina y el clotrimazol. Estas condiciones son: inóculo final: 104 ufc/ml tiempo de incubación: 7 días temperatura de incubación: 28º C punto de lectura: 100% de inhibición de crecimiento. Demostramos por primera vez que dos de los métodos disponibles comercialmente para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos, como el Etest(r) o el Sensititre Yeast One(r), pueden ser adaptados a los dermatofitos. Los métodos demuestran ser reproducibles, simples y rápidos de realizar en un laboratorio clínico asistencial. Demostramos que el tipo de inóculo (macroconidios vs. hifas), el medio de cultivo, la temperatura o el tiempo de incubación afectan significativamente las concentraciones mínimas inhibitorias y que éstas dependen del antifúngico o especie de dermatofito ensayada. En general, los estudios realizados en esta tesis doctoral aportan los primeros datos del proceso de estandarización de las pruebas de sensibilidad de los dermatofitos a los antifúngicos. SUMMARY Dermatophytes are molds that produce infections in the skin, hair and nails of humans and animals. They are usually restricted to the superficial layers of the skin and appendices but they can also affect the dermis and the subcutaneous tissue, thus causing granulomas or pseudomycetomas. Some health science professionals regard dermatophytes as a merely cosmetic problem. The real impact of these infections on the quality of life of the patients involved, however, is considerable. Patients suffering from dermatophyte infections are affected physically since they feel pain, pruritus and discomfort. They may also be affected socially, being regarded by others as lacking basic personal hygiene or as potential sources of infection. And patients who work in the food industry or in other professions where they come into contact with the public may see their careers conditioned or even truncated. These problems are exacerbated in patients suffering from chronic dermatophytoses such as onychomycosis or tinea pedis. In the case of onychomycosis, treatment failure can be as high as 25%. In the case of tinea pedis, especially moccasin-type tinea pedis, the infection may last for years and the frequency of recurrence is as high as 70%. As the treatment of dermatophytoses tends to be prolonged (since the infection is usually chronic), and as the available treatments are not very effective anyway, antifungal drug consumption and public health expenditure are high. In Spain, for example, the annual consumption of topical antifungals involves a cost of approximately 36 million euros and the consumption of systemic antifungals approximately 27,000 euros. To alleviate this problem, new antifungals are being developed. This has generated interest in testing the susceptibility of dermatophytes to these antifungals in a reproducible way. However, no reference methods for this type of fungus currently exist. In this doctoral thesis we have developed and standardized several useful methods for determining the susceptibility of dermatophytes to various antifungals. The methods tested were broth microdilution, Sensititre Yeast One(r), agar dilution, Etest(r), and disk diffusion. These methods were evaluated with a high number of strains from almost every species of dermatophyte and a large number of antifungals, some of which are already commercially available and some have only recently been synthesised. Our results provide the first database of intra- and interlaboratory reproducibility studies using the microdilution method to determine the optimal test conditions for testing the susceptibility of dermatophytes to the most commonly prescribed antifungals (itraconazole, terbinafine and clotrimazole). These optimal test conditions are: a final inoculation of 104 ufc/ml, an incubation time of 7 days, an incubation temperature of 28º C, and an endpoint criterion of 100% growth inhibition. We have demonstrated for the first time that two of the commercially available methods for testing the antifungal susceptibility of yeasts (Etest(r) and Sensititre Yeast One(r)) can be adapted to test the antifungal susceptibility of dermatophytes. We have also demonstrated that these methods are simple, quick and reproducible in a clinical laboratory. We have shown that the type of inoculum (macroconidia or hyphae), the culture medium, the incubation temperature and the incubation time significantly affect the minimum inhibitory concentrations (MIC), and that these MIC depend on the antifungal or species of dermatophyte tested. In general, the studies conducted during this doctoral thesis have provided the first information about the standardization process for the antifungal susceptibility testing of dermatophytes.