Inestabilitat cromosòmica i radiosensibilitat en cèl·lules defectives en ATM i DNA-PKcs

Abstract

ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) i DNA-PKcs (DNA-dependent Protein Kinase, catalytic subunit) són dues proteïnes que pertanyen a la família de les PIKKs (PhosphatidylInositol 3-Kinase-related Kinase) i ambdues desenvolupen funcions importants en la via de resposta al dany en el DNA (DDR). ATM i DNA-PKcs són activades en resposta als trencaments de doble cadena del DNA (DSBs) que es produeixen a conseqüència de l'actuació de múltiples factors, entre ells les radiacions ionitzants. Un cop activades, les dues cinases realitzen funcions diferents -però significativament complementàries- en aquesta via: ATM és capaç de: (1) aturar el cicle cel·lular en qualsevol fase; (2) activar diverses proteïnes implicades en la via de reparació homòloga (HR) del DNA i (3) induir l'activació de la via de l'apoptosi cel·lular en cas que el dany sigui massiu i/o irreparable. Per la seva part DNA-PKcs és una proteïna mestra de la via de reparació no homòloga del DNA (NHEJ), on activa i regula a la resta de factors participants d'aquesta via. Finalment DNA-PKcs també pot induir la via de l'apoptosi en resposta a un dany massiu. L'absència d'alguna d'aquestes dues cinases comporta, en els individus afectes, l'aparició de síndromes d'inestabilitat cromosòmica caracteritzats per una major probabilitat de desenvolupar processos cancerígens. Les cèl·lules derivades dels individus afectes són extremadament radiosensibles i acumulen aberracions cromosòmiques. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és determinar quins factors contribueixen de manera específica a la radiosensibilitat i a la inestabilitat cromosòmica de les cèl·lules deficients en ATM i en DNA-PKcs. Per assolir aquest objectiu es va analitzar: (1) l'espectre d'aberracions radio-induïdes en ambdós tipus cel·lulars; (2) l'evolució i resolució d'aquestes aberracions al llarg del temps; (3) la possible implicació del metabolisme telomèric en aquestes aberracions i (4) la cinètica de reunió de DSBs de les cèl·lules deficients en ATM i la de les cèl·lules deficients en DNA-PKcs. Després de ser irradiats, ambdós tipus cel·lulars acumulen un nombre significativament elevat d'aberracions cromosòmiques. El metabolisme telomèric només contribueix de manera marginal a la inestabilitat cromosòmica en cèl·lules deficients en DNA-PKcs i no té repercussions en la línia cel·lular deficient en ATM emprada en aquest estudi. En analitzar la cinètica de reunió dels DSBs radio-induïts es va fer palès que la deficiència en DNA-PKcs indueix un alentiment de la mateixa. Una reparació més lenta de les lesions en el DNA afavoreix (1) l'acumulació de fragments cromosòmics i, alhora, (2) la reunió il·legítima dels mateixos. La cinètica alentida explica l'ampli espectre d'aberracions radio-induïdes obtingut en aquestes cèl·lules així com la seva persistència en el temps, esdevenint el principal factor responsable de la radiosensibilitat i inestabilitat cromosòmica en cèl·lules deficients en DNA-PKcs. En canvi les cèl·lules deficients en ATM reparen la majoria dels DSBs radio-induïts amb una cinètica comparable a la de les cèl·lules normals, però una fracció dels trencaments roman sense reparar inclús a llargs temps post-irradiació. Per tant, l'acumulació de trencaments pendents de ser reparats a llargs temps post-irradiació (48 i 72 h) apareix com el principal factor responsable de la radiosensibilitat i inestabilitat cromosòmica d'aquestes cèl·lules. Però com s'explica la persistència d'aquests trencaments durant vàries divisions post-irradiació? Un cop descartat un alentiment de la cinètica de reparació ens varem plantejar la possibilitat de que l'absència d'ATM impedís la correcta detecció d'aquests DSBs. Per tal d'avaluar aquesta hipòtesi es va realitzar un anàlisi de la presència de γH2AX i Mre11 en els extrems cromosòmics trencats. La majoria de les delecions cromosòmiques presents en les cèl·lules deficients en ATM presenten marcatge amb les dues proteïnes en el punt de trencament, però una fracció considerable de les mateixes (25%) no presenta cap tipus de marcatge. El resultat obtingut suggereix que els trencaments no senyalitzats no estan essent correctament detectats i que la maquinària de reparació no és activa en ells. Proposem que l'acumulació de trencaments pendents de reparar són una característica de les cèl·lules deficients en ATM, i que aquesta acumulació contribueix de manera important a la seva radiosensibilitat i inestabilitat cromosòmica. Mentre que la fracció de trencaments correctament senyalitzats per γH2AX i Mre11 podrà ser reparada al llarg del temps, la fracció de trencaments sense senyalitzar podria romandre sense reparar durant temps indefinit, contribuint especialment a la inestabilitat cromosòmica d'aquestes cèl·lules.