Papel etiopatogénico e implicaciones diagnósticas de micrornas en el síndrome de ovario poliquístico

Resumo

1. Introducción o motivación de la tesis El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una enfermedad de alta prevalencia que afecta al 5-10% del total de mujeres en edad reproductiva, cuyos síntomas se inician habitualmente durante la adolescencia o la edad adulta temprana1,2. Esta patología se caracteriza por problemas de fertilidad3, hiperandrogenismo, oligo- o amenorrea y/o ovarios quísticos4. Además, el SOP se asocia muy frecuentemente con alteraciones endocrino-metabólicas, en ocasiones severas, tales como la resistencia a insulina y obesidad, problemas cardiovasculares y de hiperplasia endometrial que pudiera desembocar en cáncer de endometrio5,6. En este contexto, está demostrado que un diagnóstico en edad adolescente acompañado de modificaciones del estilo de vida puede evitar en un alto porcentaje el desarrollo de estas patologías asociadas7. Sin embargo, en la actualidad, se estima que más del 70% de mujeres afectadas por esta patología están mal diagnosticadas o directamente están sin diagnosticar8. Las bases fisiopatológicas de este síndrome permanecen en gran medida desconocidas, lo que obliga a un mejor conocimiento de los sistemas fisiológicos que controlan la reproducción, así como de su interacción con otras funciones corporales estrechamente relacionadas, como la homeostasis energética y metabólica9. En este contexto, datos experimentales recientes sugieren que, junto a los mecanismos genéticos clásicos, diversos sistemas de regulación epigenética participan en la modulación de aspectos clave de la función reproductiva y del estado metabólico del organismo10–12. Estos incluyen no sólo mecanismos tales como la metilación del DNA o las modificaciones postraduccionales de las histonas, sino también elementos no convencionales de regulación mediante pequeños RNAs no codificantes, de entre los que destacan los microRNAs (miRNAs)13. Diversas evidencias experimentales sugieren que el SOP se origina antes de la pubertad, o incluso que su génesis se remonta al desarrollo fetal, aun cuando numerosas manifestaciones clínicas del mismo, tanto reproductivas como metabólicas, no aparezcan hasta la edad adulta14. De hecho, dado que el diagnóstico de SOP se basa en la identificación de una serie de criterios clínicos (por ej. Criterios Rotterdam), éste se produce habitualmente de forma diferida, especialmente por la concurrencia en etapas más tempranas de cambios fisiológicos del eje reproductor (por ej., durante la adolescencia) que pueden enmascarar el cuadro15. Además, éste está condicionado por la necesidad de un diagnóstico diferencial de patologías que pudieran cursar con síntomas similares al SOP, tales como el síndrome de Cushing, la hiperprolactinemia, la amenorrea hipotalámica, los tumores productores de andrógenos o la hiperplasia suprarrenal congénita. En este contexto, la posibilidad de identificar de forma temprana pacientes con predisposición o en fases incipientes de SOP sería de gran utilidad, con objeto de prevenir las principales complicaciones reproductivas y metabólicas asociadas a esta patología. Este trabajo de Tesis Doctoral se marca como objetivo último la identificación de marcadores de utilidad diagnóstica que permitan una mejora en la caracterización bioquímica y diagnóstico temprano de pacientes con SOP, posibilitando además de una mejor estratificación de los casos, la predicción de posibles complicaciones asociadas como la obesidad. Para ello, se han realizado análisis de expresión de miRNAs en muestras de plasma de pacientes con SOP, tanto a gran escala mediante la tecnología nCounter®, como dirigidos mediante PCR en tiempo real. 2. Contenido de la investigación En base a información disponible en la literatura, se ha establecido como hipótesis de trabajo para esta Tesis Doctoral, que determinados sistemas de miRNAs participan en el control de aspectos importantes de la función ovárica, y que su desregulación puede causar determinados procesos patológicos que afectan a este órgano reproductor, tales como el SOP. Igualmente, se considera demostrado que cambios en la expresión de miRNAs específicos de tejidos, tales como el ovario y/o diversos tejidos metabólicos, en pacientes con SOP puedan tener un impacto en los perfiles circulantes de dichos miRNAs, lo que a su vez puede presentar importantes implicaciones fisiopatológicas y diagnósticas, favoreciendo en ultimo término una mejor identificación y clasificación de las pacientes afectadas. En este contexto, el OBJETIVO GENERAL de esta Tesis Doctoral es establecer un protocolo, basado en miRNAs, que permita detectar y clasificar pacientes con SOP en etapas tempranas, antes de la aparición de comorbilidades asociadas, así como avanzar en nuestro conocimiento acerca de la etiopatogenia de esta enfermedad. Para alcanzar este objetivo se han implementado estudios en muestras humanas, estableciéndose tres OBJETIVOS ESPECÍFICOS (OE): OE1: Identificar miRNAs circulantes diferencialmente expresados en plasma de pacientes con SOP. Para alcanzar este objetivo, se generó una cohorte bien establecida mediante la colección de muestras de plasma de ciento setenta mujeres de casos (SOP) y controles durante tres años seguidos. Se establecieron cuatro grupos de estudio, de acuerdo con dos variables, el diagnóstico de SOP y presencia o no de obesidad. La obesidad se definió como IMC >30kg/m2 según estándares clínicos. Se han caracterizado los perfiles clínicos, antropométricos y hormonales de los cuatro grupos de pacientes y controles establecidos, mediante el análisis de 32 variables diferentes. El análisis comparativo de estas variables en los cuatro grupos establecidos, puso claramente de manifiesto que los cambios significativos entre mujeres con SOP y controles se daban en los parámetros antropométricos o variables clínicas que comúnmente caracterizan al SOP (ecografía ováricas alteradas con ovarios poliquísticos, ciclos menstruales irregulares, hirsutismo, LH, ratio LH/FSH y testosterona), mientras que los cambios significativos entre mujeres obesas con IMC>30 kg/m2 y no obesas, ocurrieron en las variables antropométricas y clínicas relacionadas con el metabolismo. Este fenómeno ha ocasionado que todos los estudios y análisis posteriores se hayan llevado a cabo clasificando a las pacientes previamente según el umbral IMC> <30 kg/m2. Para la detección de miRNAs circulantes alterados en pacientes SOP, se llevó a cabo un análisis de expresión masiva de miRNAs mediante la tecnología nCounter® en plasma de un subgrupo de mujeres con SOP (24 muestras individuales en total, de las que 19 fueron finalmente consideradas para análisis masivo de datos, en base a controles internos de calidad), separadas según padecían o no obesidad. Nuevamente, los resultados obtenidos en este análisis masivo indicaron que para lograr marcadores útiles es más eficiente clasificar o detectar a las mujeres con SOP si previamente se estratifican según sean obesas o no obesas, ya que estos datos demuestran que la obesidad se comporta como un factor de confusión en el diagnóstico molecular de SOP; de ahí que cuando la obesidad está presente en todos los grupos de pacientes estudiadas, la comparación entre SOP y sus controles no genera diferencias significativas. Esta evidencia también está soportada por el hecho de que aquellas comparaciones entre grupos de pacientes en los que nunca coinciden la obesidad y el SOP, fueron las que mayores diferencias generaron. Así, los análisis bioestadísticos de todos los miRNAs alterados en el análisis nCounter® dieron como resultado diez miRNAs potencialmente interesantes. Por otro lado, debido a la originalidad de este estudio, se estableció la necesidad de desarrollar un sistema de referencia con capacidad de normalizar valores de miRNAs individuales. Como resultado de interés de esta tesis, se ha desarrollado un método pionero de normalización, que se ha utilizado para calcular el valor final de los miRNAs individuales utilizados como biomarcadores en SOP. El valor de normalización se obtiene de la media geométrica de hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-125a-5p y hsa-miR-1976, y ha sido nombrado como mR3, como acrónimo de "referencia por 3 miRNAs". OE2: Establecer un algoritmo o combinación única de miRNAs que junto con los datos clínicos de las pacientes permita diagnosticar y clasificar a las mismas. El siguiente paso en la búsqueda de miRNAs con capacidad de detectar y clasificar a pacientes con SOP con y sin obesidad, fue la validación individual de los candidatos seleccionados en el análisis masivo (plataforma nCounter®) del punto anterior, pero en este caso en las 176 muestras de la cohorte. En este sentido, los diez miRNAs seleccionados fueron: hsa-miR-191-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-33a-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-let7i-5p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143-3p y hsa-miR-539-5p. El mejor control para detectar mujeres con SOP no obesas (PL) fue el grupo control sin obesidad (NL), y el mejor control para clasificar a las mujeres con SOP y obesidad (PO) fue el grupo control con obesidad (NO). A partir de los datos obtenidos para estos diez miRNAs medidos en toda la cohorte, se aplicaron regresiones logísticas para determinar la utilidad de los miRNAs circulantes y sus combinaciones, a fin de lograr una identificación fiable de SOP. Estos análisis demostraron la capacidad de los diez miRNAs seleccionados para discriminar correctamente a las mujeres con SOP no obesas (PL) de las mujeres sin SOP y con IMC<30 kg/m2 (NL). Del mismo modo, este conjunto de 10 miRNAs permitió la discriminación de mujeres con SOP y obesidad (PO) frente a mujeres sin SOP y obesidad (NO). Según estos hallazgos, se construyó un árbol de decisiones para clasificar a las mujeres no obesas con o sin SOP. En este modelo, los miRNAs con mayor capacidad de clasificación fueron: hsa-miR-191-5p, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-28-3p y hsa-miR-142 -3p. Usando el mismo método, se construyó un árbol de decisión para poder clasificar a las mujeres obesas con o sin SOP. En este modelo, los miRNAs que mejor clasificaban a estas pacientes fueron hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-143-3p y hsa-miR-539-5p. OE3: Avanzar en la caracterización del papel fisiopatológico de sistemas de miRNAs en la aparición del SOP. Mientras que el conjunto de datos descritos en este trabajo define una herramienta sólida para el diagnóstico preciso de SOP, ya sea en pacientes obesas o no obesas, estos datos presentan igualmente posibles implicaciones fisiopatológicas, relacionadas con los niveles desregulados de estos miRNAs específicos, que si bien no demuestran de manera concluyente asociaciones de causalidad, sí permiten establecer inferencias de interés patogénico, ya sea para el desencadenamiento de SOP o de sus complicaciones. En este sentido, se han usado herramientas bioinformáticas para la predicción de genes y vías biológicas potencialmente desreguladas por el conjunto de miRNA seleccionados en el contexto del SOP. Estos análisis iniciales han destacado una serie de rutas comunes, algunas relacionadas con la inflamación y la señalización de insulina que pueden contribuir a la patogénesis o complicaciones de la enfermedad. Aunque estos datos iniciales requieren validación en cohortes independientes, serán la base de futuros estudios experimentales, incluyendo estudios in vitro y análisis in vivo, con el fin de revelar la contribución potencial de estos miRNAs alterados en pacientes con SOP e implicados en la aparición de comorbilidades, incluyendo alteraciones metabólicas graves. 3. Conclusión Las principales conclusiones que se derivan de esta Tesis Doctoral son: 1. Los sistemas de regulación epigenética mediados por miRNAs dejan huella en el plasma sanguíneo y están alterados en mujeres con SOP tanto obesas como no obesas. Además, los miRNAs alterados en SOP se solapan con aquellos alterados en la obesidad femenina. Por lo tanto, para un diagnóstico molecular correcto del SOP, es necesario hacer una separación previa de pacientes según IMC <>30 kg/m2. 2. Algoritmos formados a partir de los miRNAs, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-28-3p y hsa-miR-142 -3p, tienen capacidad de clasificar a pacientes no obesas con y sin SOP. 3. Algoritmos formados a partir de los miRNAs, hsa-miR-93a-5p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-143-3p y hsa-miR-539-5p, tienen capacidad de clasificar a pacientes obesas con y sin SOP. 4. La media geométrica obtenida por qPCR de los miRNAs hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-125a-5p y hsa-miR-1976 (mR3), es un buen valor de normalización para la cuantificación, mediante esta técnica, de miRNAs individuales en muestras de plasma de pacientes concretos. 4. Bibliografía 1. Stein, I. F. & Leventhal, M. L. Amenorrhea associated with bilateral polycystic ovaries. American Journal of Obstetrics and Gynecology 29, 181–191 (1935). 2. Adams, J., Polson, D. W. & Franks, S. Prevalence of polycystic ovaries in women with anovulation and idiopathic hirsutism. BMJ 293, 355–359 (1986). 3. Romero-Ruiz, A. et al. Kisspeptin treatment induces gonadotropic responses and rescues ovulation in a subset of preclinical models and women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. 32, 1915–18 (2019). 4. Escobar-Morreale, H. F., Luque-Ramírez, M. & San-Millán, J. L. The molecular-genetic basis of functional hyperandrogenism and the polycystic ovary syndrome. Endocrine Reviews 26, 251–282 (2005). 5. Dennett, C. C. & Simon, J. The Role of Polycystic Ovary Syndrome in Reproductive and Metabolic Health: Overview and Approaches for Treatment: TABLE 1. Diabetes Spectr 28, 116–120 (2015). 6. Barry, J. A., Azizia, M. M. & Hardiman, P. J. Risk of endometrial, ovarian and breast cancer in women with polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Human Reproduction Update 20, 748–758 (2014). 7. Moran, L. J. et al. Dietary composition in the treatment of polycystic ovary syndrome: a systematic review to inform evidence-based guidelines. Human Reproduction Update 19, 432 (2013). 8. Boyle, J. Polycystic ovary syndrome – an update. Australian Family Physiological 41, 1–6 (2012). 9. Pinilla, L., Aguilar, E., Dieguez, C., Millar, R. P. & Tena-Sempere, M. Kisspeptins and Reproduction: Physiological Roles and Regulatory Mechanisms. Physiological Reviews 92, 1235–1316 (2012). 10. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A. & JONES, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429, 457–463 (2004). 11. Li, Z. & Huang, H. Epigenetic abnormality: a possible mechanism underlying the fetal origin of polycystic ovary syndrome. Medical Hypotheses 70, 638–642 (2008). 12. Mimouni, N. E. H. et al. Polycystic ovary syndrome is transmitted via a transgenerational epigenetic process. Cell Metabolism 33, 513-530.e8 (2021). 13. Sørensen, A. E., Udesen, P. B., Wissing, M. L., Englund, A. L. M. & Dalgaard, L. T. MicroRNAs related to androgen metabolism and polycystic ovary syndrome. Chem. Biol. Interact. 259, 8–16 (2016). 14. Azziz, R. PCOS in 2015: New insights into the genetics of polycystic ovary syndrome. Nat Rev Endocrinol 12, 183–183 (2016). 15. Legro, R. S. Diagnostic criteria in polycystic ovary syndrome. Semin Reprod Med 21, 267–275 (2003).