Procedimiento para la detección de recombinación homóloga in vivo analizando formas de GFP recombinantes

Resumen

Procedimiento para detectar y cuantificar recombinación homóloga in vivo analizando formas de GFP recombinantes. Se emplean células de levadura expresando dos versiones de genes GFP (proteína fluorescente verde) con dos localizaciones subcelulares diferentes, una nucleolar y otra citosólica, gracias a la presencia de: a) un gen integrado en el genoma que expresa GFP fusionada a una proteína de localización nucleolar (RPA190) y b) un gen GFP en un plásmido, expresando una proteína GFP citosólica de baja intensidad. Ambas proteínas GFP-recombinantes se identifican in vivo por microscopía de fluorescencia dada su localización sub-celular.

La recombinación homóloga entre los genes GFP se cuantifica por la frecuencia de pérdida de las formas nucleolar o citosólica frente al total de las células de un cultivo. Es aplicable tanto a análisis de mutaciones en genes que afecten a frecuencia de recombinación (investigación básica) como al estudio de compuestos tóxicos como fármacos o vertidos medioambientales.